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使用暗礁珊瑚荧光蛋白ZsGreen作为可溶性报告基因建立定向突变筛选平台-Molecular Devices

日期:2015-06-26     浏览:856    下载:1     体积:701.35K     评论:0    


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使用易错PCR(epPCR)和DNA shuffling技术的定向突变筛选方法,可以向感兴趣的基因片段中引入随机 且数目可控的点突变。已有报导称这种方法可以作为筛选溶性更好突变体的工具。在使用上述方法建立的突变库中,可以使用一个间接反映蛋白折叠的报告基因来检测蛋白可溶性的改变。这种检测方法是将目的蛋白与报告基因融合表达。融合蛋白表达后报告蛋白分子的活性水平就和上游目的蛋白成功折叠与否相关。 常用的折叠报告系统一般使用GFP作为C端报告分子。不正确折叠或者聚集的融合目蛋白会阻止 C端GFP的正确折叠,因此融合蛋白就不会产生荧光。

本文对这种方法进行了优化,使它成为一个能够增加极其难溶蛋白可溶性表达的工具。我 可溶性表达的工具。我们主要关注定向突变过程的三个关键方面:首先,使用暗礁珊瑚荧光蛋白(RCFP)作为可溶性报告分子,使用Molecular Devices公司的克隆筛选系统对进行高通量鉴定。其次,测试epPCR方法联合 Invitrogen Gateway克隆系统用于构建随机突变库。然后描述了用于突变蛋白表达、纯化和鉴定的多重蛋白分析方法。
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