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中山大学刘建忠组通过基因组改造获得高产左旋多巴的大肠杆菌

   日期:2016-07-29     来源:上海工业生物技术研发中心    浏览:1860    评论:0    
核心提示:为了提高大肠杆菌以葡萄糖为底物合成左旋多巴,中山大学刘建忠课题组基于基因组改造、获得了一株高产左旋多巴的大肠杆菌。
  
 摘要:为了提高大肠杆菌以葡萄糖为底物合成左旋多巴,中山大学刘建忠课题组基于基因组改造、获得了一株高产左旋多巴的大肠杆菌。

 

中山大学刘建忠组通过基因组改造获得高产左旋多巴的大肠杆菌

 

  左旋多巴(L-DOPA)又名3-(3,4-二羟基苯基)-L-丙氨酸,是由L-酪氨酸衍生而来的芳香族化合物。L-DOPA用于治疗帕金森氏症,这是由神经递质多巴胺不足引起的疾病。孟山都公司开发了一个商业化的、合成L-DOPA的不对称氢化反应过程;目前L-DOPA的合成方法包括化学合成(不对称氢化反应)、酶催化合成以及微生物发酵合成。化学合成的极大缺陷在于转化率和对映选择性都不高,因此被利用酶催化或微生物发酵的生物技术方法替代。具有酪氨酸酶、酪氨酸酚裂解酶(Tpl)和对羟基苯-3-羟化酶(PHAH)活性的微生物都可被用于合成L-DOPA。但微生物发酵法需要酪氨酸或邻苯二酚/丙酮酸作底物,势必增加了生产成本。Nakagawa等构建了一株过表达酪氨酸酶(Streptomyces castaneoglobisporus来源)的大肠杆菌,该工程菌株以葡萄糖为发酵底物、可合成293mg/L的L-DOPA;Munoz等构建了一株带PHAH活性的大肠杆菌,它以葡萄糖为发酵底物、能合成1.5g/L的L-DOPA。然而,上述大肠杆菌以葡萄糖为底物的L-DOPA发酵量远低于那些以酪氨酸或邻苯二酚/丙酮酸为底物的发酵量。因此,后续工作应围绕提高大肠杆菌以葡萄糖为底物的L-DOPA发酵量而开展。来自中山大学刘建忠组对大肠杆菌的基因组进行了基因工程改造,最终获得一株以葡萄糖为发酵底物、合成L-DOPA水平最高的工程菌,相关结果发表在近期的《Science Reports》杂志上。

 

   在这项工作中,研究者利用单位点和多位点基因组改造方法、构建了一株以葡萄糖为发酵底物、合成L-DOPA的大肠杆菌。首先利用单位点改造方法构建了能合成L-DOPA的大肠杆菌DOPA-1,包括:敲除转录调节子(酪氨酸抑制子tyrR和碳储存调节器A csrA);将葡萄糖转运由磷酸转移系统变成依赖ATP的摄入;过表达半乳糖透性酶和葡萄糖激酶编码基因;敲除葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和预苯酸脱水酶及其导肽的编码基因;将融合蛋白嵌合体整合至分支酸盐的下游途径。然后,研究者利用多重自动基因工程方法(MAGE)对23个靶标位点进行了改造。最终获得的工程菌株——大肠杆菌DOPA-30N,在5L分批发酵过程中、在60h可合成8.67g/L的L-DOPA,这是依赖PHAH酶活性、以葡萄糖作发酵底物获得的最高水平的L-DOPA。

 
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