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口蹄疫疫苗研究进展

   日期:2017-12-06     来源:中国农业科学院兰州兽医研究所    浏览:3477    评论:0    
核心提示:口蹄疫是一种高度接触性的烈性动物一类传染病,中国采取政府强制干预的政策来防控口蹄疫疫情,疫苗也就成为最重要的一种工具。随着科学技术的不断发展,疫苗的研发技术手段、生产工艺、配套检测方法等也得到不断优化、更新。本文即对口蹄疫的疫苗研究进展做以综述,包括弱毒疫苗、亚单位疫苗、核酸疫苗、病毒活载体疫苗、转基因植物疫苗、灭活疫苗,重点讲述灭活疫苗。
  
 口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease, FMD),是由口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth Disease virus, FMDV)引起的一种热性、急性、高度接触性动物传染病。侵染对象为猪、牛、羊等偶蹄动物,易感动物多达70余种。临床症状根据感染动物物种、毒株间的差异有所不同,主要眼观临床症状为:口腔、鼻、舌面、蹄部、乳房等部位出现水泡,之后破裂形成结痂。该病虽死亡率不高,但由于其高度接触性传播,且可以通过空气传播的特性,使其在世界范围内流行,成为一种严重危害养殖业及畜产品质量和安全的政治、经济疾病。因此,世界动物卫生组织(OIE)将其列为发病必报的A类动物烈性传染病,同时中国农业部也将其列为一类动物传染病。

目前,针对该病,还没有有效、可靠的治疗手段。世界范围内,除了少数发达国家,例如:美国、英国、韩国、日本等发达国家,依靠“扑杀Stamping out”的政策控制口蹄疫外,大多数的国家仍然依靠种群计划免疫,配合消毒等措施来控制此病。但由于口蹄疫病毒在自然和有免疫压力的条件下,均易发生基因变异,导致疫苗的免疫效力下降。因此,高效、安全、稳定的口蹄疫疫苗成为控制口蹄疫疫情的关键技术条件。

疫苗在传染病的控制过程中,起着至关重要的作用。口蹄疫是一种高度接触性的烈性动物一类传染病,中国采取政府强制干预的政策来防控口蹄疫疫情,疫苗也就成为最重要的一种工具。随着科学技术的不断发展,疫苗的研发技术手段、生产工艺、配套检测方法等也得到不断优化、更新。本文即对口蹄疫的疫苗研究进展做以综述,包括弱毒疫苗、亚单位疫苗、核酸疫苗、病毒活载体疫苗、转基因植物疫苗、灭活疫苗,重点讲述灭活疫苗。 

1 弱毒疫苗

在口蹄疫的研究中,自20世纪50年代开始,就有研究者开始研发FMDV弱毒活疫苗,但之后由于技术的限制,导致毒株在模式动物体内驯化困难,同时RNA病毒在宿主体内极易由于基因突变导致毒株的反强等情况。因此,经过近20年的探索后,关于FMD的活疫苗也就逐步退出历史舞台。目前,世界范围内,仅个别国家仍使用口蹄疫弱毒活疫苗,中国禁止研发、生产口蹄疫弱毒活疫苗。

2 亚单位疫苗

所谓的亚单位疫苗就是利用基因工程手段,将口蹄疫病毒主要免疫原性蛋白,在原核或者真核细胞中外源表达,通过纯化的方式获得相对纯化的抗原。早在1975年,研究者Bachrach就亚单位疫苗进行了尝试,其尝试将VP1蛋白分离,之后进行免疫原性检测。之后1981年,Kleid等人,将VP1蛋白进行重组原核表达,从而真正的开始进入到基因亚单位疫苗的研发时代。

2.1 空衣壳疫苗

在亚单位疫苗研发的过程中,空衣壳疫苗由于其完整的病毒外衣壳结构,一直是研究者关注的热点。早在1968年就有学者提出空衣壳的概念。2007年,美国梅岛实验室研究人员首次获得口蹄疫空衣壳蛋白,且具类似灭活疫苗的免疫效果。目前,国内外均有口蹄疫空衣壳疫苗的研究报道及专利,部分已经进入商品化生产、使用阶段。

2.2 合成肽疫苗

合成肽疫苗也是一种典型的技术发展的产物,随着病毒表位被逐步研究探明,且科学技术手段可以在体外合成短肽后,研究者其利用仪器,直接将抗原表位单一或者串联的合成,从而获得抗原。此项技术操作方便,抗原纯度高,便于工业化生产,20世纪90年代后开始被研究,并逐步形成产品。目前,国内外均有相关商品化产品应用于市场。

3 核酸疫苗

核酸疫苗就是通过载体将抗原的编码基因导入到宿主细胞中,在体内进行外源表达,诱发宿主机体免疫反应的疫苗,其分为DNA疫苗和RNA疫苗。口蹄疫疫苗研发均针对DNA疫苗,尚未见RNA疫苗的报道。早在2001年,研究者就在口蹄疫研究领域,对此疫苗进行相关探索,但由于其免疫反应弱、抗体维持期短等特点。目前,此类疫苗仍停留在科研阶段,或者作为其它类型疫苗的辅助免疫手段。

4 病毒活载体疫苗

活载体疫苗指将病毒的抗原基因,通过基因工程手段插入到活病毒基因组中,病毒在细胞内复制的过程中,同时将外源基因表达。目前,针对口蹄疫研究比较多的病毒活载体主要有:腺病毒、痘病毒、杆状病毒。此项技术由于其容量大、可以插入不同的基因,同时稳定性好,体内免疫持续期长等特点,自20世纪80年代研发至今,始终是研究者的关注焦点。目前,在国内外均有相关商品化产品进入市场使用。

5 转基因植物疫苗

此项技术首次在1995年,被研究者Mason等人提出,其利用基因工程手段,将病毒抗原基因导入到植物体中表达,通过饲喂动物,从而达到免疫的效果。此思路一经提出就由于其广阔的应用前景,受到很多研究者的关注,且之后很多研究者对此进行了长期的探索,但目前由于转基因技术的争议和免疫效果的限制,还没有商品化的产品。

6灭活苗

6.1常规灭活苗

FMD常规灭活苗,是指利用常规技术生产的以灭活病毒为抗原的疫苗。此经典方法的使用已有近百年历史。1925-1929年,Belin等采用口蹄疫发病牛舌组织病料进行甲醛灭活,从而制备灭活疫苗,取得一定的保护效果,从而揭开了口蹄疫研究历史中灭活苗研发和应用的序幕。之后,1934年Schmidt和Hansen研发出氢氧化铝佐剂。1938年,Waldmann 和Kobe将FMDV灭活技术和氢氧化铝佐剂技术结合,发明出真正意义上的第一个FMD灭活疫苗——铝胶甲醛灭活疫苗,当时又被称为Schmidt-Waldmann疫苗。之后,1947-1954年,Frenkel用牛舌上皮细胞培养法发展了自己1935年研发的组织块培养病毒的技术,用此细胞培养、增值FMD病毒,成功的大规模制备了抗原。其研发的方法成功的培养了很多动物病毒,进行灭活后,生产出安全、高效的疫苗,此方法在欧洲FMD的防治历史中起到重要作用,并作为经典方法,一直沿用至今。

自1948年Sanford, K. K成功培养第一个细胞系,之后研究者一直尝试用传代细胞系来培养病毒。在口蹄疫的研究中,研究者初步摸索出PK、IBRS-2、BHK-21细胞系可以用于FMDV的增值。特别是1962年成功研发的BHK-21细胞系的研发,至今仍是FMDV研究和传代、增值过程中的经典细胞系。

自80年代至今,研究者对FMD灭活的疫苗研发中的佐剂的使用和灭活的工艺,进行了不断的探索。灭活方面,口蹄疫的研究中一直采用甲醛、乙酰基乙烯亚胺(AEI)、二乙烯亚胺(BEI)进行灭活,中国当前一直稳定采用BEI作为FMDV灭活的标准灭活剂。佐剂方面,研究者曾探索多种佐剂进行口蹄疫疫苗的免疫增强,其中有氢氧化铝、皂素、油佐剂成为研究中的经典佐剂,中国当前在FMDV灭活疫苗的生产中,多采用油佐剂中的206佐剂。

1990年,科学家Zibert首先完成FMDV全长感染性克隆的构建,并从构建的cDNA中拯救出病毒,从而开启了反向遗传操作FMDV基因组的序幕。之后研究者一直用此技术,探索FMDV基因结构中,各个基因的作用和功能。同时,研发者也注重运用反向遗传操作技术,改造FMDV的特性,提高其抗原性和生产滴度,从而更加适应疫苗的研发和生产过程。

在口蹄疫的研究中,虽然近期也有很多研发者研发很多新型疫苗,但常规灭活疫苗一直是当前世界范围内,所采用的控制FMD疫情的主要手段。各国研究者,根据国家或地区的疫情,研发型间特异性疫苗,或者多价FMD灭活苗,进行FMD的控制。

6.2 标记疫苗

正是由于在口蹄疫等重大疾病中,OIE发布的“扑杀”的政策,使得在实际生产中,如何采用血清学的快速、高通量、低成本的进行“区别病毒感染与疫苗免疫”成为研究者一直致力于探索的目标。特别是进入21世纪之后,反向遗传学等新型技术的引入和使用,使得FMDV的标记灭活疫苗从理论逐步走向生产实践。

2003年德国科学家Hohlich, B.J.等,利用肽扫描技术,鉴定了FMDV SP and NSP中的一系列表位,并建立肽抗原ELISA方法从而区别感染和免疫。但仅对此方法做了初步探索,未进行实际应用,可能原因则是用肽为抗原,对于临床血清中的反应,不如3ABC全蛋白覆盖范围全面。

2007年美国梅岛实验室,研究者鉴定了出3D蛋白上的一个表位:3D16-30,并制备此表位的单抗,利用此单抗建立竞争ELISA方法来区别感染和免疫。首先,将3D蛋白包被,之后加入血清和单抗,最后加入二抗,从而建立一种竞争ELISA,检测血清中的3D抗体。

2007年韩国Oem, J.K.等人,利用表达的3AB作为抗原,孵育血清,之后用酶标3B的单抗鉴定显色,从而区别感染和免疫,此方法类似国内的3ABC方法。优势在于消除了种属的差异性。

2008年pirbright实验室,Fowler, V.L.等人,将VP1的G-H环进行型间的替换,尝试构建多价疫苗,并用于鉴别感染和免疫。其在检测中利用合成替换的VP1(135-156)为抗原,进行包被,并用甲醇固定,之后加入血清,之后加入动物二抗,从而建立peptide-base ELISA, 但此方法好像用处不大。之后,其又建立竞争ELISA,将integrin avβ6包被,封闭后加入抗原,结合后加入血清和针对G-H环的单抗,最后加入二抗,建立抗体夹心竞争ELISA检测抗原。

2010年pirbright实验室,Fowler, V.L等人,将VP1的G-H loop删除了13个氨基酸,作为一种分子标记,构建重组毒,之后利用针对病毒的兔抗和一株针对G-H环138-154位点的单抗建立一种抗原捕捉夹心ELISA方法。首先,将兔抗包被,之后加入抗原,再加入单抗,最后加入二抗,从而区别此毒株和野毒,但此方法有一个缺陷,检测抗原的方法在生产中比较难以利用,样品难以制备。

2010年西班牙Arias, A.等人,设计实验,直接将VPg2删除,并将VPg3末端几个重要的氨基酸构建到VPg1上(小RNA病毒是一类用蛋白起始RNA复制的病毒,除了3B,2C和3A可能也在复制中起到重要作用),发现VPg3全长是不需要的,但此病毒不呈斑,此后在BHK上传代后发现呈斑,并通过测序确定2C R55W突变是呈斑的关键因素,此实验为标记的重组毒提供一定的启示。

2011年pribright实验室,Fowler, V.L等人,提出一种思路,FMDV VP1结构中G-H环是多余的,将其删除后,构建了一系列的重组毒,同时利用此段是整合蛋白受体结合位点的特征,建立抗原捕捉ELISA方法来区别此毒株。首先,将avβ6蛋白包被,封闭之后加入抗原,再加入血清抗体,之后加入动物的二抗,从而鉴别此毒株,此方法可行,但弊端也是生产中检测抗原比较困难。

2012年梅岛实验室, Uddowla, S.等人设计实验构建重组毒,首先删除L蛋白功能区,仅保留第一个AUG到第二个AUG中间的84个nt,(FMDV-L是一个毒力相关蛋白,有研究表明,LAB和LB中,发挥功能的主要是后者),之后将3B1删除,并将3B29-12位的RQKP替换为PVKV(此序列从BRV牛轮状病毒中比对发现), 之后将3D中30和31位FN变为YR。实验中,竞争ELISA建立:首先将3D蛋白包被,加入血清和竞争单抗(次单抗针对突变位点),之后加入鼠二抗,从而鉴别此疫苗毒株。之后其又建立3B为抗原的ELISA方法,将3B2合成后包被,加入血清和单抗(此抗体针对突变区原位点)进行竞争3B,从而区别此疫苗毒株和感染抗体。

2014年,国内李平花等人将3A上93-143肽段删除,构建重组毒,并使用一株针对3A99-105的单抗建立阻断ELISA方法,从而进行区别感染与免疫。同年,国内付元芳等人,利用一株针对3B2-GPYAGPMER的单抗,建立固相阻断ELISA,从而配套重组毒进行区别感染与免疫。

随着科学技术的逐步发展,动物病毒的研发技术水平和生产工艺也逐步得到提升与完善。当前,世界范围内,对于多种病毒的研究和控制过程中,标记苗的概念已经不仅是理论中的概念,而逐步被研发者提出、实践、发展和完善。在中国,目前猪伪狂犬病毒的研究中,标记苗技术已经被成熟的运用,传统的灭活苗正逐步退出历史舞台。笔者相信,在未来的5-10年内,口蹄疫标记灭活疫苗会得到快速的发展和完善,传统灭活口蹄疫疫苗会逐步退出研发者的视野。

 

结语

在口蹄疫的防控中,国际普遍采用,在无疫区“免疫”,疫病爆发时“扑杀”的政策。英国1967-1968、2001年的两次口蹄疫大流行中均采用此政策,取得很好的后期效果,成为国际消灭动物疫病过程中,“扑杀”政策的典范。“扑杀”政策,优点是可以在短期内根除疫情,恢复“无FMD”国家或地区的地位,但实施的过程中,耗资巨大,不仅需要强大的经济实力作为后盾,并且需要完善的兽医防疫体系的支撑。目前,大多数国家还是依靠计划免疫来控制此类传染病。 

口蹄疫及其疫苗研究,已有百余年历史,目前也有亚单位疫苗、核酸疫苗、病毒活载体疫苗、转基因植物疫苗等新型疫苗的商品化产品推出。同时,很多研究者也对其进行了技术水平和免疫效力的评估。但目前,FMD新型疫苗在免疫效力和经济水平上,还不足以和传统的FMD灭活疫苗进行竞争。但随着技术的发展,相信未来会有更安全、高效、廉价、稳定的口蹄疫疫苗问世,从而在世界范围内控制并最终消除口蹄疫。

中国农业科学院兰州兽医研究所口蹄疫疫苗研究进展
 
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