乳糖-N-新四糖（Lacto-N-neotetraose LNnT）是一种丰富的母乳寡糖（HMO），已被批准作为婴儿配方奶粉的新型功能添加剂，其生物合成引起了广泛的关注。其中，大肠杆菌合成LNnT是以甘油作为碳源进入细胞生成两个重要前体5′-二磷酸尿嘧啶核苷-N-乙酰基葡萄糖胺（UDP-N-acetylglucosamine，UDP-GlcNAc）和UDP-半乳糖（UDP-galactose，UDP-Gal）。然后UDP-GlcNAc与外源添加的乳糖在外源引入的β-1，3-N-乙酰葡糖胺基转移酶LgtA催化下生成中间体LNTII。最终LNTII与UDP-Gal在外源引入的β-1,4-半乳糖基转移酶LgtB催化下生成LNnT。LNnT的生产通常伴随大量LNTII积累。

近日，江南大学吴敬等在《J. Agric. Food Chem.》发表文章“High-Level Production of Lacto-N-neotetraose in Escherichia coli by Stepwise Optimization of the Biosynthetic Pathway”，改造大肠杆菌构建了高产LNnT，低残余LNT II的生产菌株。首先失活了lacA、lacZ、wecB、nagB、gcd 和ugd基因阻断了乳糖、UDP-N-乙酰葡糖胺和UDP-半乳糖分解途径，再引入β-1,3-N-乙酰葡糖胺基转移酶LgtA和β-1,4-半乳糖基转移酶LgtB，构建了能够生产LNnT的底盘菌株。随后，为增强UDP-GlcNAc和UDP-Gal合成路径，过表达了glmM、glmU-S*、galE。接下来通过过表达乳糖内运蛋白lacY，失活LNT II外运蛋白SetA增加了乳糖和LNTII供应。UDP-GlcNAc和UDP-Gal的生物合成需要三磷酸尿苷(Uridine triphosphate, UTP)，细胞内UTP的合成以5-磷酸核糖-α-焦磷酸(5’-phosphoribosyl pyrophosphate，PRPP)作为前体, 因此过表达了PRPP合酶基因prs基因以增加UTP的供应。经过上述改造LNnT滴度仍相对较低，因此将LNnT合成途径分为三个模块: 由lgtA，glmU-S*和glmM编码的LNT II合成模块、由lgtB、pgm、galE和galU编码的LNnT合成模块和由lacY和prs编码的协调输送模块。以不同拷贝数的质粒进行组合表达显著提高了LNnT产量，获得菌株LNnT产量最高为5.96 g/L，残余1.36 g/L LNT II。最后，通过调节必需基因lgtB，prs和lacY的翻译起始强度微调通路通量。最终，LNnT在摇瓶中的产量达到6.70 g/L，残余0.80 g/LLNT II。在3 L生物反应器中达到19.4g/L，生产强度为0.47 g/（L h），LNT II残留量为1.79 g/L ，生产强度水平为目前报道最高，LNT II残留量迄今为止最低。