脱氧野尻霉素最高产量：代谢工程改造菌株产量达1632.5mg/L

背景

糖尿病是全球范围内的常见慢性病。1-DNJ作为一种α-糖苷酶抑制剂，可用于对Ⅱ型糖尿病的治疗，且具有诸如抗肥胖，抗病毒、抗肿瘤等多种生理活性，在药物、功能性食品中有广泛的应用前景。目前，1-DNJ可以从天然物质（如桑叶）中进行提取，但存在步骤繁琐、成本高昂的问题。化学合成法获得1-DNJ也存在步骤繁琐，成本高的问题，且由于存在对映异构体的原因，给分离纯化带来困难并影响药效。利用微生物合成1-DNJ具有易培养、生产成本低的优势。芽孢杆菌和链霉菌是合成1-DNJ的主要菌种，但当前发酵产量仍然较低，因此，进一步提高1-DNJ发酵产量对于工业生产具有重要价值。来自湖北大学，华中农业大学的多名作者从1-DNJ产生菌Bacillus amyloliquefaciens HZ-12 出发，通过代谢工程的改造，从优化葡萄糖转运途径、增加1-DNJ合成前体供应、增强1-DNJ合成基因的表达和相应mRNA的转录三个方面着手改造，最终在3升发酵罐中1-DNJ的产量提高至1632.5mg/L，为当前报道的最高产量。该研究发表于期刊《Synthetic and Systems Biotechnology》上。

过程

首先，作者团队从菌株中的葡萄糖转运体系着手改造以提高葡萄糖的利用效率。芽孢杆菌中葡萄糖主要通过磷酸转移酶系统（PTS）和非磷酸转移酶系统（NPTS）转运入胞内。1分子葡萄糖从PTS进入细胞需要消耗1分子PEP，伴随着一分子丙酮酸的生成。作者将ptsG基因的启动子替换为弱启动子Pundh，减少了PEP的消耗并强化了NPTS的葡萄糖转运途径，作者还敲除了NPTS的负调节基因iolR，进一步加强NPTS，使得1-DNJ滴度达到110.72mg/L。是出发菌株（21.03mg/L）的5.26倍。

图1 淀粉芽孢杆菌代谢工程用于高效生产α-葡萄糖苷酶抑制剂1-脱氧野尻霉素，包括葡萄糖转运途径、F-6-P代谢节点和1-DNJ合成酶基因簇的模块。

其次，作者通过削弱旁支途径提高1-DNJ合成前体F-6-P的供应进而增强目标产物的合成。作者首先尝试了分别敲除pfkA和pfkB基因，发现敲除pfkB基因可以增加产量，而敲除了pfkA会严重影响菌体的生长，因此改为将弱启动子Pundh导入用来抑制基因pfkA的表达，并敲除pfkB基因，还应用强启动子PbacA来增强果糖1，6-二磷酸酶基因glpx以提高F-6-P供应，使1-DNJ滴度上升至169.41mg/L。F-6-P也可以由肽聚糖合成前体6-磷酸-N-乙酰葡萄糖胺经过脱乙酰反应（nagA）和脱氨基反应（nagB）得到。nanR基因对这两个反应起负调控作用。作者便敲除负调控基因nanR，促进GlcNAc-6-P向F-6-P的转化。滴度达到267.37mg/L。

接着，作者对1-DNJ合成基因簇进行改造。将基因gabT1,yktC1,gutB1的启动子替换为启动子P43、PbacA、和双重启动子PykzA-P43，产量分别增加25.49%、41.80%和47.47%。选取替换为双重启动子PykzA-P43的菌株进行下一步操作。作者对菌种1-DNJ的合成基因簇研究发现，基因gabT1的翻译水平高于yktC1和gutB1。作者认为5’-UTR在其中发挥了重要作用，对于5’-UTR的替换可以降低mRNA的二级结构的ΔG，从而增加mRNA二级结构的稳定性和翻译水平。作者依次将基因gutB1和yktC1的5’-UTR改为UTR12(GTATATTAGAAAGGAGGAATATATA)，增强了mRNA的翻译水平和稳定性，促进了产物的合成，1-DNJ滴度最终提升至478.6mg/L。并且副产物乙偶姻和2，3-丁二醇的产量减少。最后，作者将上一步取得的菌株于3L发酵罐中发酵，发酵期间pH控制在6.5与7.4之间，中途葡萄糖补料，使得葡萄糖含量维持在5-10g/L，前50h细胞快速生长，72小时生物量达到最大，1-DNJ从48h开始产生，60h后1-DNJ产生速度加快，发酵96h得到最高滴度1632.5mg/L。

总结与展望

本文开发了一种可以高效生成1-DNJ的工程菌。作者从优化碳源的转运途径，增加前体供应，加强合成基因簇三个方面着手改造菌株，并在最终的发酵中获得了较高产量。碳源的利用方式在细胞生长和目标产物合成中处于核心地位，在代谢工程的改造中应当优先考虑。削弱旁支途径提高合成前体供应也可大幅提高产物水平，并降低副产物水平。

在代谢工程中，基因簇的存在也是不可忽视的，本文中对于基因簇中下游基因的低水平表达提供了一个新的解决方法，即通过优化5’-UTR提高mRNA的二级结构稳定性进而加强基因的表达水平，可为构建其他工程菌提供借鉴。

总之，该研究大幅提高了1-DNJ的产量，为大规模制备该产物及其衍生物奠定基础，该研究中开发工程菌的思路和策略也可以为代谢工程改造其它菌株提供借鉴。

参考文献

1. Xujie L,Zhang M,Yu L, et al. metabolic engineering of Bacillus amyloliquefaciens for efficient production of α-glucosidase inhibitor1-deoxynojirimycin[J]. Synthetic and Systems Biotechnology, 2023.

2.芦玉. 代谢工程改造解淀粉芽胞杆菌高产1-脱氧野尻霉素[D].华中农业大学,2020.DOI:10.27158/d.cnki.ghznu.2020.001193.

3.程相锦. 1-脱氧野尻霉素高产工程菌的构建及发酵工艺[D].华中农业大学,2018.DOI:10.27158/d.cnki.ghznu.2018.000187.

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译者：诸雍翌