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100万转让重组牛肠激酶项目Bovine, Recombinant Enterokinase (rEK),Expressed inP. Pastoris

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最后更新: 2019-08-30 15:59
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公司基本资料信息

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详细说明
一、 项目简介
牛肠激酶为一异二聚体的丝氨酸蛋白酶,体内主要产生部位为十二指肠,主要生理作用是将胰蛋白酶原转变为胰蛋白酶。其具有极高的生物活性和专一的识别位点(DDDDK,Asp-Asp-Asp-Asp-Lys),切割特异性好,裂解产物与天然产物一致(不残留任何识别序列氨基酸),温度及PH适应范围宽(pH 4.5~9.5,4~45℃,),稳定性好。其轻链(即小亚基)为催化亚基,分离的轻链即具有肠激酶的酶活性和特异性。由于天然肠激酶来源有限,并且从动物组织提取的肠激酶有其它蛋白和病毒污染风险。因此用基因工程方法生产肠激酶催化亚基,成为最为可行和经济的生产重组牛肠激酶(rEK)的路线和方法。
 
由于牛肠激酶催化亚基的特殊结构,其对表达后蛋白的糖基化修饰要求高,其含有的二硫键结构使其蛋白三维结构稳定,保证了牛肠激酶催化亚基具有高的生物活性。另外,含牛肠激酶催化亚基基因序列的质粒在宿主细胞内表达会产生一定的毒性,造成了重组牛肠激酶表达和纯化比较困难。本项目利用基因工程技术方法通过构建重组牛肠激酶催化亚基-6His的毕赤酵母表达系统,解决了其在毕赤氏酵母中分泌表达重组牛肠激酶催化亚基-6His的生物活性和产量的难题,并通过亲和等层析方法进行分离纯化,获得的重组牛肠激酶催化亚基具有高效、特异切割融合蛋白的生物活性,完全达到和满足实际应用的需要,为基因工程下游过程中重组融合蛋白质的切割提供一个有效、价廉的工具酶。
 
二、 应用领域
重组牛肠激酶广泛应用于生物工程制药行业及基因工程研究领域。基因工程实践中经常使用融合表达进行目标蛋白质的表达、生产,运用最 多的融合蛋白或短肽标签等。借助于融合蛋白或短肽的生化特征和性质,融合表达能大大
简化、方便产物的检测,性质研究和分离纯化。因此目前在基因工程中,从原核表达体系到真核表达体系都经常采用融合表达方法进行重组目标蛋白质的生产。但这同时也带来了新的问题,即融合蛋白的特异性去除问题。当重组蛋白质作为基因工程药品及其它一些用途时,目标产物必须是像天然蛋白质一样的完整产物,而不能以融合蛋白形式使用。因此融合表达产物必须进行产物后加工:即融合蛋白在体外实施特定氨基酸序列的切割或断裂,才能获得完整的目标产物。
 
肠激酶因其识别位点非常的严谨且唯一(识别位点:Asp-Asp-Asp-Asp-Lys ),能高效去除目标蛋白 N 端多余氨基酸,具有极高的生物活性和特异性。其被广泛用于生物工程制药业及基因工程、生物化学、分子生物学等研究和应用。但从天然来源(动物血液或肠)分离、纯化的肠激酶,得率低,纯度高,因此价格昂贵,在大规模生产运用时,无疑会大大增加成本,且由于痕量天然杂质蛋白酶的存在,会导致目的产物的降解。因此用有效价廉的重组牛肠激酶已成为生物工程制药业及基因工程研究人员的急需,具有广阔的市场空间。
 
三、 技术路线
1
 
四、 项目优势
1、 技术成熟,已经产业化:项目已完成表达载体构建、菌种筛选、发酵和纯化工艺开发及放大,已获得高表达菌株和稳定的生产工艺,目前在300L、500L规模发酵条件下进行重组牛肠激酶试剂产品的生产和销售,并已获得市场好评。
2、 活性好,专一性强:本项目选择毕赤酵母表达系统进行表达,重组牛肠激酶的活性和专一性比原核表达更好;
3、 产量高,稳定性好:发酵上清表达收率可达16000U/L发酵液(活性单位:在37℃,16小时内将1mg的质控蛋白95%降解为目的蛋白所需要的酶量定义为1个活性单位,即1U),且纯化后产品经多次冻融和长期保存酶切效果无明显下降。
4、 易于去除,无残留:含6个His重组标签,易于快速分离去除。
 
五、 生产成本
市场上同类产品规格有100U/支、1000U/支及定制50000U/支,对应价格分别为300~700元/100U,1000~2000元/1000U和3~5万元/50000U,本项目在500L规模发酵及对应纯化条件下,生产成本约为573元/50000U,利润空间巨大。
 
六、 项目技术交接
1、高表达毕赤酵母菌株;
2、生产工艺资料(稳定的发酵工艺,稳定的纯化工艺)
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