巨大芽孢杆菌β-淀粉酶在枯草芽孢杆菌中诱导表达及碳代谢去阻遏

郭瑞1,2 , 李由然1,2 , 王均华1,2 , 石贵阳1,2     

摘要：
【背景】 β-淀粉酶在食品和医疗领域应用广泛。目前工业上使用的β-淀粉酶主要从植物中提取，生产成本高，限制了β-淀粉酶的应用。微生物生产的β-淀粉酶尽管早有报道，但由于产酶水平低下，因而一直未能实现工业化。
【目的】 实现巨大芽孢杆菌β-淀粉酶在枯草芽孢杆菌中的高效诱导表达，缓解碳分解代谢物阻遏(Carbon catabolite repression，CCR)对该重组酶表达的影响，并研究其酶学性质。
【方法】 克隆枯草芽孢杆菌木糖诱导启动子，构建木糖诱导表达载体以介导巨大芽孢杆菌1514的β-淀粉酶编码基因amyM在枯草芽孢杆菌中的异源表达。定点突变位于amyM信号肽编码区的分解代谢物响应元件(Catabolite responsive element，CRE)，降低碳源代谢对重组β-淀粉酶施加的阻遏。
【结果】 构建了诱导表达β-淀粉酶基因的重组枯草芽孢杆菌菌株。同义替换amyM-CRE保守碱基在不同程度上缓解了碳源所施加的CCR效应，重组酶的表达水平得到显著提高。重组酶的分子量为57 kD，水解可溶性淀粉主要生成麦芽糖和少量葡萄糖，其中麦芽糖含量为72%。该酶最适作用温度为50 ℃，最适反应pH为6.0。Co2+、Ca2+对重组β-淀粉酶具有激活作用。
【结论】 通过木糖诱导表达系统和碳代谢去阻遏实现了β-淀粉酶在枯草芽孢杆菌中的高效表达，酶活最高可达97.16 U/mL发酵液，比amyM基因来源菌巨大芽孢杆菌1514的β-淀粉酶产量提高了440倍，为β-淀粉酶发酵生产的工业化提供了支撑。

关键词：枯草芽孢杆菌     木糖诱导启动子     β-淀粉酶     碳分解代谢物阻遏     分解代谢物响应元件     酶学性质    

Inducible heterologous expression and carbon catabolite repression of β-amylase from Bacillus megaterium in Bacillus subtilis

GUO Rui1,2, LI You-Ran1,2, WANG Jun-Hua1,2, SHI Gui-Yang1,2     

Abstract: [Background] β-Amylases have been widely used in food and medical fields. Most industrial β-amylases are extracted from plants, hampering the application of β-amylase due to high costs. Microbial production of β-amylase has been reported before but has not been industrialized because of the low yields. [Objective] To achieve an efficient inducible expression of a β-amylase from Bacillus megaterium in Bacillus subtilis, relieve carbon catabolite repression (CCR) exerted on the expression of recombinant β-amylase and characterize the recombinant enzyme. [Methods] A xylose-induced vector was constructed to mediate the expression of the amyM gene from Bacillus megaterium 1514 encoding a β-amylase in Bacillus subtilis. CCR of the recombinant β-amylase was studied by site-directed mutagenesis of the catabolite responsive element (CRE) located within the signal peptide-encoding region of amyM. [Results] The recombinant Bacillus subtilis that inductively expressed the β-amylase was obtained. The yield of the recombinant enzyme was significantly improved by silent mutagenesis of conserved nucleotide within amyM-CRE. The recombinant β-amylase had a molecular size of 57 kD and hydrolyzed soluble starch to yield 72% maltose and a little glucose. The enzyme was optimally active at pH 6.0 and 50 ℃. Co2+ and Ca2+ increased the efficiency of enzymatic hydrolysis. [Conclusion] Highly efficient expression of β-amylase was achieved to provide experimental support for the industrial production of β-amylase from fermentation.

Keywords: Bacillus subtilis     Xylose promoter     β-amylase     Carbon catabolite repression     Catabolite responsive element     Enzymatic properties    

β-淀粉酶(β-amylase)，全称为α-1, 4-葡聚糖-4-麦芽糖水解酶(α-1, 4-D-glucan maltohydrolase，EC 3.2.1.2)，能够从淀粉的非还原末端水解相隔的α-1, 4-葡萄糖苷键，产生β旋光性的麦芽糖，最早被发现于高等植物中，但许多微生物也能产生该酶[1-5]。β-淀粉酶在食品加工、医药和纺织等领域具有重要的应用价值，例如水解淀粉生产麦芽糖浆和酿造啤酒等[6]。利用微生物发酵生产β-淀粉酶不受气候和原料的影响，产物性质稳定均一，可以实现自动化生产。然而，野生型菌株发酵困难、产酶量低，难以大规模工业化生产[7]。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是目前工业酶制剂生产中应用最广泛的菌株之一，优点包括蛋白合成量高、安全性高且发酵技术成熟，其木糖诱导启动子因调控严谨、诱导物安全无毒且诱导强度高，被广泛用于外源蛋白的大规模发酵生产[8-9]。

微生物来源的β-淀粉酶表达量低与受到碳分解代谢物阻遏(Carbon catabolite repression，CCR)有关。碳分解代谢物阻遏是指微生物在混合碳源发酵时优先利用速效碳源(通常为葡萄糖)，且该碳源的代谢产物会抑制其他非速效碳源代谢相关的基因表达和蛋白活性，从而影响非速效碳源利用的现象[10]。枯草芽孢杆菌等低G+C mol%含量革兰氏阳性菌的CCR效应中起主要作用的调节蛋白是分解代谢物控制蛋白(Catabolite control protein A，CcpA)[11]，该蛋白在DNA上的顺式作用元件被称为分解代谢物响应元件(Catabolite responsive element，CRE)[12]，为14 bp的回文序列，其共同序列(CRE consensus sequence)为：TGWNANCGNTNWCA (W：A/T；N：A/G/C/T)。CcpA通常需要先与辅助蛋白HPr-Ser46-P或CPr-Ser46-P形成调节蛋白复合物，再结合CRE以阻遏相关基因的转录[13]。细胞内HPr-Ser46-P和CPr-Ser46-P的水平间接反映葡萄糖的存在和水平[14]。对CRE的研究发现，利用定点突变等方式使其偏离CRE共同序列，CCR效应将得到有效缓解[15-16]。

本研究构建的木糖诱导表达载体首次实现了巨大芽孢杆菌β-淀粉酶基因amyM在枯草芽孢杆菌中的功能表达，并研究了重组酶的酶学性质。通过同义替换amyM-CRE保守碱基，缓解了该基因在枯草芽孢杆菌中受到的CCR效应，为微生物发酵生产β-淀粉酶打下了基础。

1 材料与方法 1.1 菌种、质粒和引物

巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium) 1514、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) WB600、大肠杆菌(Escherichia coli) JM109、大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒pHY300-PLK由中国高校工业微生物资源和信息中心(CICIM)保藏。表达宿主菌枯草芽孢杆菌A610是枯草芽孢杆菌WB600淀粉酶基因amyE缺陷菌株，由江南大学粮食发酵工艺与技术国家工程实验室保藏。实验涉及的菌株和质粒见表 1。

研究中所用的引物及其序列见表 2。引物设计使用Primer Premier 5.0软件。引物由金唯智生物科技有限公司(苏州)合成。

1.2 培养基、主要试剂和仪器

LB培养基(g/L)：酵母粉5.0，蛋白胨10.0，NaCl 10.0。抗性筛选时补加终浓度为100 mg/L的氨苄青霉素或30 mg/L的四环素。

HisTrap亲和层析结合缓冲液：20 mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4 (pH 7.4)，0.5 mol/L NaCl，20 mmol/L咪唑；洗脱缓冲液：20 mmol/L Na2HPO4- NaH2PO4 (pH 7.4)，0.5 mol/L NaCl，150 mmol/L咪唑，洗脱流速为1 mL/min。

DNA聚合酶、T4 DNA连接酶，宝生物工程(大连)有限公司；各种限制性内切酶，Fermentas公司；质粒提取试剂盒、核苷酸片段纯化试剂盒以及胶回收试剂盒，博大泰克(北京)生物基因技术有限公司；氨苄青霉素和四环素，生工生物工程(上海)股份有限公司；其他试剂，国药集团(上海)有限公司。

可见分光光度计，上海美普达仪器有限公司；凝胶水平电泳仪，北京六一仪器厂；冷冻离心机，HITACHI公司；高速离心机，Thermo公司；凝胶成像系统，Bio-Rad公司；高效液相色谱(HPLC)系统及工作站，Dionex公司。

1.3 基因组DNA的提取

枯草芽孢杆菌WB600、巨大芽孢杆菌1514基因组DNA的提取参照Wilson等的方法[17]。

1.4 木糖诱导载体pX的构建

根据NCBI上的序列信息，设计PCR引物Xyl-F/Xyl-R，以枯草芽孢杆菌WB600染色体为模板，使用Pfu DNA聚合酶进行扩增，经测序验证后获得枯草芽孢杆菌木糖异构酶基因的启动子及其调控蛋白基因片段xylR-Pxyl。PCR反应条件：95 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 50 s，72 ℃ 2 min，29个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃保温。PCR反应体系(100 μL)：上、下游引物(25 μmol/L)各1 μL，模板1 μL，Pfu DNA聚合酶(0.01 U/μL) 48.5 μL，ddH2O 48.5 μL。扩增产物纯化后经Hind Ⅲ和Bgl Ⅱ双酶切，连接至同样酶切的载体pHY300-PLK上，转化大肠杆菌JM109，经测序正确后获得木糖诱导载体pX。

1.5 amyM-6*His融合基因的克隆及重组质粒pXMH0的构建

通过比对NCBI上已公布的巨大芽孢杆菌β-淀粉酶基因的序列，设计引物MH0-F/MH0-R，以巨大芽孢杆菌1514染色体为模板，扩增得到β-淀粉酶融合基因片段amyM-6*His。PCR反应条件和反应体系同1.4。PCR产物纯化后与木糖诱导载体pX连接，转化大肠杆菌JM109，经筛选鉴定正确后获得重组质粒pXMH0，测序后获得amyM基因序列。

1.6 携带突变型amyM-CRE重组质粒的构建

使用Super Pfu DNA聚合酶，以质粒pXMH0为初始模板，MH1-F/MH1-R为引物进行扩增。PCR产物经Dpn Ⅰ消化处理后转化大肠杆菌JM109，经筛选和测序正确后获得同义替换了1个amyM-CRE保守碱基的重组质粒pXMH1，并以其作为模板进行下一轮突变扩增。通过上述方法，依次获得了同义替换了2–4个amyM-CRE保守碱基的重组质粒pXMH2、pXMH3和pXMH4。PCR反应条件：95 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 4 min，24个循环；72 ℃ 10 min。PCR反应体系(100 μL)：上、下游引物(25 μmol/L)各1 μL，模板1 μL，Super Pfu DNA聚合酶(0.01 U/μL) 48.5 μL，ddH2O 48.5 μL。

1.7 重组枯草芽孢杆菌的构建

分别将质粒pX、pXMH0、pXMH1、pXMH2、pXMH3和pXMH4通过Bott等[18]的方法转化到表达宿主枯草芽孢杆菌A610中，经转化子筛选鉴定正确后，获得重组菌株BAX、BAXMH0、BAXMH1、BAXMH2、BAXMH3和BAXMH4。

1.8 序列分析和同源性比较

采用在线BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/ BLAST/)和软件SnapGene 2.3.2分析序列；信号肽序列用软件Signal-P 3.0分析预测[19]。

1.9 重组β-淀粉酶的诱导表达及粗酶液的制备

将重组菌BAXMH0接种于15 mL LB培养基中，在37 ℃、200 r/min振荡培养，以此作为种子液。将培养过夜的种子液按3% (体积比)的接种量接种于30 mL LB培养基中，37 ℃、200 r/min培养8 h后，加入终浓度为1%的木糖诱导发酵16 h。取一定量发酵液，4 ℃、12 000 r/min条件下离心10 min，上清液即为粗酶液。

1.10 β-淀粉酶活力检测、蛋白质测定和电泳分析

取0.95 mL用Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液(0.2 mol/L，pH 6.5)配制的1%可溶性淀粉作为底物，于40 ℃预热5 min后加入50 μL适当稀释的β-淀粉酶酶液，40 ℃反应30 min。取500 μL反应液，加入1.5 mL DNS煮沸5 min，于540 nm处测定吸光值，计算产生的还原糖量。将麦芽糖烘干至恒重后，制作梯度标样，绘制DNS标准曲线。β-淀粉酶酶活单位(U)定义为：在40 ℃、pH 6.5的反应条件下，每分钟水解可溶性淀粉生成相当于1 μmol麦芽糖的还原糖所需的酶量，定义为1 U。

蛋白质浓度测定采用Bradford法[20]。SDS-PAGE电泳参照Sch gger等[21]的方法。

1.11 重组β-淀粉酶的纯化

利用HisTrap亲和层析进行重组β-淀粉酶的纯化。收集纯化后的酶液，利用SDS-PAGE鉴定蛋白纯度及分子量大小。

1.12 重组酶水解产物的检测

色谱柱，SUGAR SH1011糖分析柱；检测器，示差检测器；流动相，10 mmol/L稀硫酸；流速，0.6 mL/min；柱温，50 ℃。

2 结果与讨论 2.1 木糖诱导启动子和β-淀粉酶基因的克隆与分析

以枯草芽孢杆菌WB600基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得大小约为1.4 kb的片段，如图 1所示。经测序确认该扩增片段与NCBI登记的枯草芽孢杆菌木糖异构酶基因启动子及其调控蛋白基因片段xylR-Pxyl的序列(GenBank登录号为A00033)完全一致。

以巨大芽孢杆菌1514基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得大小约为1.6 kb的β-淀粉酶融合基因片段amyM-6*His (图 1)。经测序分析，融合基因amyM-6*His全长1 656 bp，编码551个氨基酸和一个终止密码子，预计编码蛋白分子量为61 kD，其中氨基酸序列1-31位为信号肽序列，32-545位为结构编码区，546-551位为组氨酸标签，成熟重组β-淀粉酶蛋白的分子量为57 kD。amyM基因的GenBank登录号为KY744244。通过在线BLAST比对分析，发现amyM基因与已报道的巨大芽孢杆菌DSM319[16]和蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)[22]的β-淀粉酶基因分别有94%和72%的相似性。除此之外，通过序列分析发现巨大芽孢杆菌1514 β-淀粉酶基因amyM的信号肽编码序列中存在CRE，其序列组成为：TGTTAACGCTTTCA，完全匹配共同序列TGWNANCGNTNWCA (W：A/T；N：A/G/C/T)。

2.2 木糖诱导表达β-淀粉酶重组质粒pXMH0的构建

将片段xylR-Pxyl克隆到大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒pHY300-PLK，获得木糖诱导载体pX。将片段amyM-6*His克隆到载体pX，获得木糖诱导表达β-淀粉酶重组质粒pXMH0 (图 2A)。重组质粒pXMH0经Bgl Ⅱ和Sal Ⅰ双酶切后得到6 252 bp的pX载体片段和1 662 bp的amyM-6*His融合基因片段(图 2B)。

2.3 重组β-淀粉酶的表达

使用化学转化的方法，将重组载体pX和重组表达质粒pXMH0分别转入表达宿主枯草芽孢杆菌A610中，所得阳性转化子经提取质粒、酶切电泳验证无误后，获得重组菌株BAX和BAXMH0。

将重组菌株BAX和BAXMH0分别进行摇瓶发酵，培养条件及诱导方法同1.9节，以不加诱导剂的一组作为空白对照，发酵结束后冷冻离心发酵液，上清即为粗酶液。酶活力检测结果显示，对照组BAX以及未添加木糖诱导的BAXMH0发酵上清中均未检测到重组酶活力，只有添加木糖诱导的BAXMH0发酵上清中检测到淀粉酶活力，表明巨大芽孢杆菌1514的β-淀粉酶基因amyM在枯草芽孢杆菌中实现了诱导表达，并且构建的木糖诱导表达系统调控严谨，完全受诱导剂木糖的调控。SDS-PAGE电泳分析结果如图 3所示，仅添加木糖诱导的BAXMH0发酵上清在分子量为57 kD左右有一条明显的条带。amyM基因来源菌巨大芽孢杆菌1514于37 ℃、200 r/min培养24 h后，发酵上清β-淀粉酶活力仅为0.22 U/mL。相比之下，经木糖诱导的BAXMH0发酵上清中的β-淀粉酶活力达到10.32 U/mL，酶活力提高了46倍，表明该木糖表达系统具有高效诱导表达的特性。

2.4 突变amyM-CRE对重组菌利用不同碳源发酵产酶的影响

由于amyM-CRE位于信号肽编码区域，为了不影响酶蛋白分泌效率，考虑同义替换amyM-CRE的保守碱基，以考察突变CRE对重组酶表达受到的CCR的影响。

以重组质粒pXMH0为初始模板设计引物进行PCR扩增，获得分别同义替换了1–4个amyM-CRE保守碱基的重组质粒pXMH1、pXMH2、pXMH3和pXMH4，如图 4所示。分别转化到表达宿主枯草芽孢杆菌A610中，获得重组菌BAXMH1、BAXMH2、BAXMH3和BAXMH4。

将重组菌BAXMH0、BAXMH1、BAXMH2、BAXMH3和BAXMH4分别在添加了不同碳源(葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉、麦芽糊精或马铃薯淀粉)的LB培养基中进行摇瓶发酵，培养条件及诱导方法同1.9节，发酵结束后检测重组酶活力，以在LB培养基中诱导发酵作为空白对照，结果如表 3所示。

在空白对照LB培养基中，重组菌株之间产β-淀粉酶的水平无明显差别。然而，无论LB中加入速效碳源(葡萄糖、果糖、蔗糖和麦芽糖)还是迟效碳源(麦芽糊精、可溶性淀粉和马铃薯淀粉)，携带突变型amyM-CRE的重组菌株发酵生产的β-淀粉酶活力均远高于携带原始型amyM-CRE重组菌，这说明突变amyM-CRE保守碱基能够有效缓解重组枯草芽孢杆菌代谢碳源过程中对重组酶表达的阻遏。Kraus等[23]研究枯草芽孢杆菌木糖操纵子中的CRE序列，结果表明CRE序列与共同序列相似性越大，抑制作用越强烈。定点突变使CRE序列偏离共同序列，阻遏复合物无法有效识别和结合CRE，从而不能在转录水平上阻遏重组酶的表达，因此，重组β-淀粉酶表达水平得到显著提升。

在添加相同碳源的情况下，重组菌BAXMH2、BAXMH3和BAXMH4的产酶水平无明显差别，但均高于重组菌BAXMH1的产酶水平，这表明当amyM-CRE中保守碱基同义替换个数超过1个后，重组β-淀粉酶表达水平并不随着保守碱基同义替换个数的增加而增加，这可能是因为当CRE的保守碱基替换2个后，阻遏复合物已经无法结合该突变型CRE，继续突变保守碱基并不会对重组酶表达水平有明显影响。

以葡萄糖或果糖为碳源时，携带野生型amyM-CRE的重组菌株完全不表达β-淀粉酶，携带突变型amyM-CRE的重组菌虽然产β-淀粉酶，但表达水平十分低下，表明葡萄糖和果糖施加的CCR效应非常强烈，即使通过突变amyM-CRE缓解了CCR效应也无法大幅提高重组菌在含高浓度葡萄糖或果糖培养基中的产酶水平，这可能是因为葡萄糖和果糖施加的CCR效应影响更加广泛、抑制作用更加持久，包括诱导物木糖的转运都被强烈阻遏，无法进入胞内发挥诱导作用[15]。Singh等[24]研究表明，碳源通过CcpA介导的CCR发挥抑制作用的能力存在明显的等级差异，其中葡萄糖的阻遏效应最强烈，果糖次之。

重组菌株利用迟效碳源产酶的水平远高于利用速效碳源，这可能是因为迟效碳源需要先被重组β-淀粉酶水解成速效碳源后才能被重组菌株利用，这一机制将培养基中速效碳源的浓度维持在相对较低的水平，从而进一步缓解CCR效应并提高重组酶的表达。以马铃薯淀粉为碳源时，重组菌株BAXMH4发酵上清液中β-淀粉酶活力最高，达到97.16 U/mL，比amyM基因来源菌巨大芽孢杆菌1514 β-淀粉酶的表达水平提高了440倍。

2.5 重组β-淀粉酶的纯化

重组菌表达的β-淀粉酶经亲和层析纯化后在SDS-PAGE中显示出单一条带，分子量约为57 kD (图 5)，与之前推测的成熟重组酶蛋白大小相符。

2.6 重组β-淀粉酶的酶学性质分析

 

2.6.1 重组β-淀粉酶的水解性质

以1%可溶性淀粉为底物，加入50 μL纯化后的重组酶，在40 ℃、pH 6.5条件下反应60 min。运用高效液相色谱法分析反应产物，标样图谱见图 6A，反应产物液相图谱见图 6B。结果显示，水解产物由72%麦芽糖及28%葡萄糖组成，表明该重组β-淀粉酶水解可溶性淀粉的产物主要为麦芽糖，还有少量葡萄糖为副产物。

 

2.6.2 温度对酶活力和稳定性的影响

pH 6.5时，在不同温度下测定β-淀粉酶的活力，以最高酶活力为100%计算相对酶活，获得温度-酶活力曲线，如图 7A所示。该重组酶最适反应温度为50 ℃，反应温度高于55 ℃时酶活力骤降。将酶液在不同温度中分别保温60 min后检测剩余酶活力，以未保温的酶液活力为100%，获得温度-稳定性曲线，如图 7B所示。重组酶活力在温度不超过45 ℃时较稳定，50 ℃保温60 min后酶活损失近70%，结果表明该酶热稳定性较差，在高温条件下酶活力损失严重。

 

2.6.3 pH对酶活力及酶稳定性的影响

在温度40 ℃条件下，测定不同pH条件下的重组酶活力，最高酶活力为100%，得到pH-酶活力曲线，如图 7C所示。结果显示该酶的最适反应pH为6.0左右，pH低于3.5酶活力基本丧失，pH高于7.0酶活力开始明显下降。在20 ℃条件下，将不同pH的酶液保温60 min后测定其残余酶活力，以未处理的原酶液活力作为对照，结果如图 7D所示。由图 7可见，pH 4.5-5.5之间该酶稳定性相对较好，pH低于4.0酶稳定性明显降低，pH高于6.0酶活力损失较高。

 

2.6.4 金属离子对重组酶活性的影响

以原酶液为对照，分别添加KCl、MgCl2、ZnCl2、CaCl2、MnCl2、CuCl2、CoCl2、FeCl2、FeCl3至终浓度1 mmol/L和10 mmol/L并测定酶活力，结果如表 4所示。在试验浓度下，Ca2+和Co2+对该重组β-淀粉酶均具有激活作用，其中Co2+对酶激活作用最强；Zn2+、Mn2+、Cu2+、Fe2+和Fe3+对该酶有较强抑制作用，10 mmol/L的Cu2+对酶抑制作用最强烈。

 

2.6.5 重组β-淀粉酶的底物特异性

取适当稀释后的β-淀粉酶50 μL分别与1%的可溶性淀粉、马铃薯淀粉、麦芽糊精、β-环状糊精、糖原和支链淀粉在40 ℃、pH 6.5的条件下反应30 min，分别测定其酶活力，以1%可溶性淀粉为底物测得的酶活力为100%，结果如表 5所示。结果表明，该重组β-淀粉酶可以水解可溶性淀粉、马铃薯淀粉、支链淀粉、麦芽糊精和糖原，但不能利用β-环状糊精，这可能是由于β-环状糊精分子结构为环状，没有非还原性末端的显露，因而重组β-淀粉酶无法作用于该底物。该重组酶可以作用于含有支链的多糖，但水解效率相对较低。根据相对酶活，该重组β-淀粉酶的最适作用底物为可溶性淀粉。

3 结论

本研究利用木糖诱导表达系统首次实现了巨大芽孢杆菌β-淀粉酶基因amyM在枯草芽孢杆菌中高效诱导表达。通过同义替换位于amyM信号肽编码区的分解代谢物响应元件的保守碱基，在不影响重组酶蛋白分泌效率的前提下，缓解了碳源代谢对重组β-淀粉酶表达施加的阻遏，重组菌发酵上清中β-淀粉酶活力最高达到97.16 U/mL，比amyM基因来源菌巨大芽孢杆菌1514 β-淀粉酶表达量提高了440倍，为β-淀粉酶发酵生产的工业化提供了数据支撑。酶学性质分析发现，该重组酶分子量为57 kD，最适反应温度为50 ℃，最适反应pH为6.0，Ca2+、Co2+对该重组β-淀粉酶具有激活作用，Zn2+、Mn2+、Cu2+、Fe2+和Fe3+对该酶有较强抑制作用。酶水解淀粉主要产生麦芽糖以及少量葡萄糖为副产物。后续研究可以关注酶蛋白的改造以提高该酶的热稳定性，并对产酶发酵条件进行优化，以期进一步提高产量，从而推动微生物生产β-淀粉酶的工业化。

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