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杨顺楷:与东瀛相比国内茶氨酸生物制造项目研发现状实在难尽人意!

放大字体  缩小字体 发布日期:2017-12-27  来源:yangsk的个人博客  浏览次数:206
核心提示:目前茶氨酸生产的工艺技术路线有利用茶叶的植化提取法,经由焦谷氨酸途径的化学合成法,已经或正在研发的酶催化合成法。酶法合成主要有5条工艺技术路线:
  
 1.研发背景情况简介

基于我国传统氨基酸工业发酵产业发展现状,仅以梅花集团和阜丰生物两家公司的谷氨酸(L-Glu)产能就达到120万吨/a。如今每年百万吨级谷氨酸产品不得不作为低值轻化工及食品调味剂(味精)产品进入国内外市场。如何经过工业生物技术的研发,将此大宗低值谷氨酸产品生物转化成为高值国内外市场看好的L-茶氨酸(L-Theanine)产品,就成为化工和生物科技工作者应当选准的研发项目,合理切入进行《生物制造》研发。茶氨酸(g-谷氨酰乙胺)作为一种植源性非蛋白氨基酸(茶叶中存在仅有1-2%含量),鉴于它在食品,保健品以及医药行业的广泛用途,至少对其生物功能研究涵盖8个方面,即神经保护作用,改善记忆和认知功能障碍,抗抑郁,镇静/抗焦虑,保护肝脏,抗肿瘤,降血压,以及增强人体免疫力。显然对其市场需求量越来越大。

日本早在1964年就批准L-茶氨酸为食品添加剂,美国也于85年FDA已经认证茶氨酸成为公认的安全(GRAS)物质。于是国内外对它的生物合成技术就进行了广泛研究,其中以日本为先导,对其开展了大量实验研究;我国学者也紧跟这一热点,发表了数量众多的论文。

目前茶氨酸生产的工艺技术路线有利用茶叶的植化提取法,经由焦谷氨酸途径的化学合成法,已经或正在研发的酶催化合成法。酶法合成主要有5条工艺技术路线:

其一,利用谷氨酰胺加上反应物乙胺,经由谷氨酰胺酶(GLS,EC 3.5.1.2)催化合成茶氨酸。1998年日本学者就报道了利用硝基还原假单胞菌(IFO 12694)整细胞在高底物浓度下(0.7M谷氨酰胺,1.5M乙胺)的硼酸缓冲液(pH11)介质体系中,生物转化产物茶氨酸积累浓度达到47g/L;日本太阳化学公司(2003)也在专利文献报道利用分离选育的香茅醇假单胞菌GEA10克菌体配制转化体系,即0.3M谷氨酰胺,0.9M乙胺, pH10,30〬C酶转化24小时,得到40g/L茶氨酸;并在工业规模开发制茶氨酸方面获得一定程度上的成功。国内王春晖(2005)报道筛选到一株可合成茶氨酸的硝基还原假单胞菌,整细胞催化合成茶氨酸最大生成量达41.38 g/L。

其二,利用谷氨酰转肽酶(GGT,EC 2.3.2.2)在E.coli的重组子中高表达及纯化,经由殷志敏团队(2011)应用小泛素修饰(SUMO)酶蛋白融合技术,其谷氨酰转肽酶具有极高的转肽活性,在选定的培养转化反应体系中,生物转化谷氨酰胺和乙胺产出茶氨酸达41 g/L;本工作还获得过国家发改委数百万元经费资助,首次在国内进行了工业规模生产线试制,未见有产品面市。

从日本学者2002年报道来自大肠杆菌(E.coli)K12的GGT可转化谷氨酰胺和乙胺产出茶氨酸以来,国内对GGT技术途径制茶氨酸很快形成研发热点,至今热度不退,发表许多论文。在此仅仅以2篇论文为例,说明闭门造车是不可取的。傅嘉懿等(2016)的“g-谷氨酰胺转肽酶补料法合成茶氨酸工艺研究”,L-茶氨酸生成量达到573.2 mmol/L(100g/L);黄峰等的“重组大肠杆菌高效催化合成L-茶氨酸”(2016);作者文中坦言“目前报道的利用GGT催化L-谷氨酰胺合成L-茶氨酸的产量并未达到工业化要求”,但是作者建立了全流程的实验研究工作内容,含有从酶反应液中分离提取L-茶氨酸的方法,即利用阳离子树脂吸附,氨水洗脱(得率82.90%),旋转蒸发浓缩,乙醇结晶,干燥样品回收率56.30%,总回收率可达46.60%。这就为下游工程提供了可借鉴的思路,虽然建立起全流程的实验研究路线,GGT催化L-谷氨酰胺合成L-茶氨酸固有的缺点并未得以克服,即酶活力低和自转肽的副产物问题。

看来,GGT酶法合成茶氨酸在国内形成虚幻热点。问题在于脱离国内基础原材料提供的现实,L-谷氨酰胺与谷氨酸(钠)的供给价位至少是10:1;过分渲染反应过程位点特异性和光学选择性强的学术价值,反应过程中也不消耗ATP;忽视谷氨酰胺酶法水解过程的复杂性,以及因为自转肽反应生成副产物问题,降低了茶氨酸产率;加之,对于早期利用硝基还原假单胞菌(IFO 12694)整细胞在高底物浓度谷氨酰胺,和乙胺酶促合成茶氨酸的酶系统经过表征及分类研究,本身就存在争议(胞外杂合蛋白V.胞内蛋白?),甚至有学者直言认为该菌株细胞内就存在可以酶法转化合成茶氨酸的谷氨酰胺酶“GLS”和谷氨酰转肽酶“GGT”。这种细菌酶学基础研究的复杂性必然导致“GGT”技术途径酶法生产茶氨酸的不确定性,仓促上中试生产线必然导致失败。

前述的2条酶法技术途径,即GLS和GGT均需要提供价位高的谷氨酰胺作为底物,谷氨酰胺与谷氨酸钠比较,二者价格差别至少是10:1;加之酶活力低,副产物,产物分离产品纯度不高,致使总收得率低,制造成本高,难有竞争力 。

其三,利用谷氨酰胺合成酶(GS,EC 6.3.1.2)催化合成茶氨酸。日本学者(1986)年报道了应用细菌谷氨酰胺合成酶与酵母偶联系统催化谷氨酸生产g-谷氨酰甲胺和g-谷氨酰乙胺(L-茶氨酸)以来,就开创了利用价廉的谷氨酸(钠)与乙胺借助酵母糖酵解ATP转移系统/GS 酶法合成茶氨酸的新起点。其后,日本学者(2004-2006)在恶臭假单胞菌Y-30菌株作了一系列研究,从对该菌株的谷氨酰胺合成酶(GS)在菌株生长培养基含有甲胺的生理营养调节下,无细胞提取物对其GS的纯化及表征,结果表明该酶在以谷氨酸和乙胺作为底物,伴有酵母成醇发酵的ATP再生的反应混合物中可以生成L-茶氨酸,在高浓度乙胺条件下,L-茶氨酸产物积累量达到30g/L;通过对Y-30菌株GS酶基因的分子克隆及遗传重组,重组菌株实现将GS酶活力提高30倍,成为在伴有偶联发酵条件下该重组GS可用于茶氨酸酶法生产;这些结果意味着要进一步提高茶氨酸的高产物浓度生产,应该在反应介质体系中增加谷氨酰胺合成酶酶量,然而这是不可行,原因在于恶臭假单胞菌Y-30菌株的GS对乙胺的低反应活性,同时也难于提供大量GS酶生产的解决方案。

目前根据谷氨酰胺合成酶(GS)氨基酸序列的同源性可将其分为四大类(1995),GSI,GSII,GSIII和Gln T;所有GS酶家族序列同源性低(<35%同一性)但是关键的氨基酸,以及涉及催化功能及结构特点的5个区域在所有5大GSs酶家族均是高度保守的。GSI主要存在于原核生物细菌,由glnA基因编码;GSII则主要在植物内生菌(细菌-植物共生体)和真核生物发现,由glnII表达产物; GSIII,由gln N编码,近来在少数专性厌氧菌和兰细菌(藻)发现;Gln T 分离自根瘤菌属,其亚基分子量和数目,以及对底物的亲和力与GSIII(gln N)差异极大,但是在文献报道时常常将Gln Ts作为“GSIII”。本文GSIII由gln N编码以GSIIIN表示,以及由gln N编码的Gln T(GSIII)一起标示为GSIII T,以避免由“GSIII”引起的混乱。根据一些调节特性和氨基酸序列的相似性,又可将GSI进一步划分为GSI-a和GSI-b(受磷酸酰苷酰化共价修饰)两大亚型,可见GS酶学基础研究的复杂性。详细的生物化学分析表明GSI,GSII,GSIIIN在经由催化氨和谷氨酸的缩合生成谷氨酰胺的氮同化作用中起了关键作用,但是根瘤菌属的GSIII T具有很低的谷氨酰胺生成活性,虽然GSIII T的基因互补E.coli的营养缺陷型;这就让人提出一个问题,是否该酶的原初功能就是谷氨酰胺合成。提到的Methylobacillus flagellatus KT是一个基于GSIII T(41%)同源性无任何功能信息,从理论推导出来的一个酶,并且尚未研究其实用意义。

国内同时期有人(2008)也开展了将荧光假单胞菌GS基因的分子克隆及遗传重组的实验研究,基因工程菌株催化谷氨酸(钠)与乙胺反应生成茶氨酸的产量仅有6.2 g/L。国内外对这些细菌谷氨酰胺合成酶的研究表明,有必要寻求对底物乙胺具有高反应活性的微生物新型酶类。已经知道有一些细菌可以生长在以甲胺为唯一碳氮源的生理营养培养条件下;这一甲胺代谢过程的中间体就是g-谷氨酰甲胺(g-GMA)被合成;其生物催化是在以谷氨酸,甲胺和ATP作为底物,由来自细菌细胞的酶(g-GMAS,L-谷氨酸盐;甲胺连接酶,生成ADP,EC6.3.4.12)得以完成。这种微生物产GMAS酶的菌株分离自海洋专性甲基营养菌(Methylophaga sp.)AA-30(1992),该微生物的“共代谢”酶学性质已经报道对甲胺有活性,对氨无活性,而对乙胺呈现高反应活性。这就提示该酶借助能量转移偶联发酵体系可以用于茶氨酸的酶法生产。这就可能建立起一种生物转化技术制备L-茶氨酸。

其四,转化L-谷氨酸与乙胺在利用专性甲基营养菌的g-谷氨酰甲胺合成酶(GMAS,EC 6.3.4.12))酶转化合成L茶氨酸(1986)技术途径。日本学者(2007-2009)从一类专性甲基营养菌分离筛选出一株类似GS酶产生茶氨酸的菌株(Methylovorus mays)NO9,在生长培养条件下为甲胺所诱导产生GMAS,分离的酶在中性范围对乙胺具有高反应活性,可由谷氨酸和乙胺在含有酵母糖发酵的ATP再生反应混合物中产生L-茶氨酸 ;对编码NO9菌株的酶基因(g-GMAS)分子克隆与遗传重组,在E.coli中重组表达,结合酵母偶联糖酵解ATP再生,酶法转化反应介质体系中合成茶氨酸的技术途径建立起来。日本学者获得的最好的研究结果是在600mlmmol/L L-谷氨酸钠,600mlmmol/L盐酸乙胺,300mmol/L葡萄糖,200mmol/L磷酸钾缓冲液(pH7.0),30 mmol/L,5 mmol/LMnCI2,5 mmol/L AMP,30U/ml GMAS和40g/L酵母细胞的1ml混合体系中,酶法转化反应48h合成约110g/L茶氨酸。

国内目前有2家报道了基因克隆与遗传重组g- GMAS酶法合成茶氨酸的实验研究结果:1)李元等(2016)构建了共表达PPK和GMAS的重组菌株,有效实现了基于PPK的ATP再生系统,在37°C,pH7.0条件下利用反应物谷氨酸钠和等当量盐酸乙胺,在0.2L反应体系酶法合成茶氨酸。添加催化量的ATP,底物浓度400mML-Glu和乙胺的条件下,实现摩尔产率为84%(=58.9g/L);2)李晚君等(2015)发明专利申请公布号CN 105200075 A;发明名称:用于茶氨酸生产的质粒及其相应工程菌的构建与使用方法。目前在5L和100L实验发酵罐中,酶法合成茶氨酸已经达到的水平为43.0g/L和30g/L。这就预示开通了技术-经济可行的工业g- GMAS酶法合成茶氨酸新途径。

尽管如此,国内毕竟还是有张玥(2012)开展了从土壤样品定向分离专性甲基营养菌的g-谷氨酰甲胺合成酶(GMAS)微生物野生型菌株的基础工作,结果获得13株纯培养物,较高活性GMAS菌株C2是真核酵母,分类鉴定为真核微生物近玫色锁掷孢酵母(Sporidiobolus pararoseus)。这一工作显然具有从天然源分离具有生物技术用途微生物酶转化合成L-茶氨酸应用基础研究的重要性。

其五,g-谷氨酰半胱氨酸合成酶(GCS,EC 6.3.2.2)生物催化合成L- 茶氨酸。在以底物谷氨酸和半胱氨酸在ATP再生功能条件下,实现酶法合成g-谷氨酰半胱氨酸,这是生物体内合成谷胱甘肽的关键酶。日本学者(2009)借助重组质粒于E.coli表达g- GCS,并利用葡萄糖酵解提供的ATP,转化反应体系历经18小时,能以429 mM乙胺合成12.1mM L-茶氨酸(=2.12g/L)。目前国内尚无人关注此技术途径酶法合成茶氨酸。

 

2.回顾国内过去近20年在茶氨酸《生物制造》R&D上官科vs.民科的博弈

四川同晟氨基酸公司(德阳)是一家典型的民营企业。鉴于我国谷氨酸发酵产能(百万吨级)世界第一的现实,在新世纪初该公司高管层积极支持年轻研发人员选准大宗产品谷氨酸钠作为基础原料,率先在国内采用化学法经由焦谷氨酸途径,开发成功国内市场稀缺的高值商品L-茶氨酸进入市场。但是化学法工艺固有的弊端,如原料利用率低,高能耗,环保问题均是与发展低碳经济的绿色化工制造方向相悖,自然应该是走生物制造(生物转化)之路。于是在2013年春开始发展同中科院成都生物所生物催化与分子进化实验室的科技合作。初期阶段仍然从利用硝基还原假单胞菌整细胞生物转化谷氨酰胺和乙胺生成茶氨酸技术途径起步,获得目标产物茶氨酸实验研究的正结果;怎奈通过菌种选育及发酵参数优化的常规手段,均难以达到预期目标。于是第二阶段就开始采用合成茶氨酸目标酶基因的分子克隆及遗传重组手段,构建基因工程菌用于茶氨酸的酶法合成实验研究。

经过文献调查,结合生物信息学数据,选定g-谷氨酰甲胺合成酶(GMAS)路线,构建酶基因分子克隆与遗传重组的工程菌株,建立起了细胞培养和相应的利用谷氨酸钠和乙胺,结合酵母糖发酵的ATP再生体系,建立起酶法合成茶氨酸的技术体系。于2015年申请了发明专利,申请公布号CN 105200075 A,技术水平如前所述,已经达到可以进行工业应用开发的研究水平。与此同时,国内中科院天津工业生物技术研究所李元等也报道(2016)多聚磷酸激酶和谷氨酰甲胺合成酶共表达重组菌株的构建及其在L-茶氨酸合成中的应用,产率达到60g/L的高水平。

实际上,国内科研院所过去20年来,已经在茶氨酸的生物制造项目上作了大量的实验研究工作,培养出不少的硕士和博士毕业生,在国内外科技期刊发表了不少论文。但是仍然没有多少引人注目的突破性进展。同期日本学者较长期开拓规范性的R&D工作,终于率先在太阳化学公司取得酶法工业开发L-茶氨酸的初步成功(后来又停产)。

这对国内科技界长期习惯于浅层次追踪或跟风研究热点的人士来说,这就自然非常吸引国内人士眼球。尤其是在国内生物技术产业发展“优势”地域,官方体制内握有话语权者优先占领有利位置,抢先组织队伍,多路人马齐上阵,大兵团作战,以网络广告预先铺天盖地舆情优势开路;同时立项资助此热点研究,结果也发表了不少论文。最终在“小圈子”里,选拔出高学历人才作为“领军人物”披挂上阵,直至拿下“国拨”数百万经费,仓促上马进入工业化开发。至今,据说项目执行情况是生产线已经停产数年,弄得国家发改委没法验收资助项目。虚假广告词提到的“已建成年产30吨L-茶氨酸,国内首家,全球第二;无锡XXXX公司已有L-茶氨酸 300吨产能为国内唯一经由发酵转化生产L-茶氨酸的企业”,纯属假话谎话连篇,子虚乌有。

这一说词与现实严重不符,现在不妨将说假话谎话者的广告词部分摘录如下,以嚮读者。

(1)以广告词开路的网络舆论,令人不明究里。例如说道:

“常州阿格罗生物科技有限公司是一家专业研发和生产L−茶氨酸等手性物质的企业。是国内首家采用生物转化生产L-茶氨酸的企业。建立了不同于日本太阳公司的生物酶法生产L-茶氨酸的技术,国内首家,全球第二。”

点评:有自吹自擂之嫌,自封是“国内首家,全球第二”,骗取国家数百万经费倒是首家。


“公司依托NJ师范大学生命科学研究院的强大技术力量,集合NJ大学、NJGY大学、JN大学等学校高新技术成果,使科技成果实现产业化。公司具有雄厚的资金实力和很强的技术开发能力及市场拓展能力。”

点评:是否科技成果实现了产业化?没有正面回复。实质上自“九五”以来,你们形成了“官科”的项目地域垄断小团体。

“  生产过程中不加入任何的化学催化剂,不需要高温、高压,使用的原料为L-谷氨酰胺和乙胺,因此,产品的安全性高。”

点评:国家《125》中的生物制造(生物催化或生物转化)提纲中的应有之义,还需多说?

“CZXXX生物科技有限公司应用生物转化法已建成年产30吨L-茶氨酸,国内首家,全球第二;无锡XXXX公司已有L-CAS 300吨产能为国内唯一经由发酵转化生产L-茶氨酸的企业。”

点评:事实真相是:日本太阳化学公司使用原料为L-谷氨酰胺和乙胺取得酶法工业开发L-茶氨酸的初步成功,仍然存在有缺点,如酶活力低,副产物问题。日方听闻常州XXX生物科技有限公司,和无锡XXXX公司有如此高水平生物制造技术,特地派员考察。如情况属实,太阳化学还想找他们代工(该产品);据称上海诚志股份还专门调研过这个项目;业内人士称:估计酶法成本没优势,市场似不确定。

这就是我国以官方垄断体制(俗称“官科”)主宰在茶氨酸生物制造研发项目上过去近20年的真实运作情况,即“官科”是输家,“民科”正在艰难崛起。

3.历史的经验值得注意,犯过的错误切忌重演

这种类似的氨基酸酶法合成《生物制造》新技术项目已经有过前车之鉴。例如在国家层面的《九五攻关》时期,我国当时一直稀缺的L-苯丙氨酸产品项目研发也已经出现过类似的《民科》胜过《官科》的案例。《民科》横向途径研发的L-苯丙氨酸之红酵母(PAL)/肉桂酸技术途径,在通过公斤级中试的省部级技术鉴定后,选定合适的科技型企业,立足中试技术-经济学评估基础上,科学合理设计构建了一条百吨级生产线,较为顺利完成百吨级苯丙氨酸工业化试制,产品很快占领国内市场,逐步取代进口产品,致使得L-苯丙氨酸产品(工业级)进口价从20万元/吨,逐步下降到5-6万元,有力地推动了我国甜味剂阿斯巴甜产业发展。笔者至今认为,红酵母(PAL)/肉桂酸技术途径作为我国首次实现非粮途径工业化酶法试产L-苯丙氨酸成功(2000多吨产品面市)的生物制造技术,还有继续恢复生机的可能;因为工业酵母菌株在连续传代40代后,酵母细胞内积累的垃圾DNA,可导致菌种生物催化性能持续下降;借助现代的分子杂交(敲除某些基因)技术,可以重新将我们从天然源分离选育的工业红酵母(PAL)菌种CIBAS A1401重新恢复高生物催化活力,再次投入工业规模化生产,以节粮代粮生产苯丙氨酸。

反观当时承担了国家《九五攻关》L-苯丙氨酸项目的《官科》体制内人士还在继续“攻关”,开展所谓的“海因法”技术途径(本质上就是微生物转氨酶/苯丙酮酸技术途径;《七五攻关》已经表明此技术途径不可行,化学合成苯丙酮酸底物技术难度大),该途径设计的根本问题在于底物的化学合成,据称“海因”的化学合成一步的原料乙腈还需进口;加之酶法转化的氨基供体是L-天冬氨酸,较之前者的氨水作氨基供体原料价高得多。最后还不是硬撑着由“官方体制”主宰,专家“鉴定验收”草草收场。

近年常州阿格罗生物科技有限公司的酶法生产茶氨酸项目,立足《官科》支持的“高学历人才”基础研究工作基础上,在缺乏可靠的中试技术-经济学评估基础,仓促上生产线,结果弄得骑虎难下,尴尬收场。国家发改委支持的数百万元资助经费又不得不“交了学费”,《官科》途径支持的酶法合成茶氨酸项目又以失败告终。有鉴于此,难道不该问责吗?

这一失败项目值得记取的教训是什麽?首先,过分迷恋“高学历人才”在国内外发表的一系列与此相关的吸引眼球的高影响因子基础研究学术论文;其次,技术持有者缺乏酶法合成的工程概念,即如何从一个专长实验室基础研究的“科学家”(发表论文)身份,转换成为一位合格的《生物制造》工程師这一重要“角色转换”环节出了问题。这两者之间是既有区别又有联系的工作过程,切勿超越;第三,选择错了企业合作伙伴(本质上是乡镇“农民企业家群体”,不具备从事生物化工的软硬基础条件)。

4.茶氨酸《生物制造》研制规范概要

笔者基于个人过去近50年国内外从事微生物生物转化及应用的职业研究工作经历,围绕前述茶氨酸《生物制造》论题作了较为充分文献调查。发现过去20年来,涉及生物转化或微生物酶法合成领域,国内所发表的大量实验研究论文,以及各类科研院所研究生导师培养研究生的毕业论文,包括硕士和博士学位论文的实验研究工作内容单薄,选题狭窄,实验技能及实验设计欠规范;所做的实验研究工作十分零碎分散;所发论文数量多,质量不高,多数均为浅层次“跟风”,追“热点”式研究。看不出对生物液体或发酵化学过程精准数据分析方法学数据资料;生物催化定量时程曲线不明晰或粗糙;涉及酶法合成关键内容的制备实验往往缺失或不详。这样的生物转化应用基础研究结果难于积累生物代谢过程的真实知识,更何况还要进入经由中间试验,进行技术-经济学评估合格后,才谈得上基于工程概念上的工业化流程设计及试制,酶法工业开发(生物制造)L-茶氨酸才有成功的可能。

.生物转化或微生物酶法合成实验设计规范如下:

—定义所要进行的反应类型;(针对现有涉及茶氨酸酶法合成酶学分为5类的现实,即GLS,GGT,GS,GMAS,和GCS,选定目标酶,并文献调研其微生物生物化学及分子生物学基础酶学性质;)

—供筛选研究的微生物菌株选择;(含传统及基因克隆及遗传重组技术选育和/或构建菌株,如从天然源采样借助富集培养技术分离含有目标酶的野生株和搜集现成菌株进行筛选;结合生物信息学数据开展酶基因克隆及遗传重组,再结合高通量筛选,获得可供产生高活力生物催化剂—酶的供试菌株,该菌株作为工业应用开发最好是以培养的整细胞(酶活力/酶量具佳)优化形式作为生物催化剂进行酶法合成);

—建立底物和所预期代谢产物的生物液体分析方法学;(TLC-HPLC或GC,结合质谱检测);

—菌种筛选实验研究;(经过初筛和复筛获得的阳性菌株,选择出稳定性好,初步确证具有液体培养制备细胞培养物作为生物催化剂酶促合成目标产物能力的供试菌株);

—转化条件及其参数的最优化;(生物转化介质体系可以是直接发酵的液体培养物,或者选择合适的缓冲液或者别的介质体系进行酶法转化);

—数批稳定可重现的制备规模(克量级)实验研究;(这是生物转化最终必不可少的制备合成实验,它可以为液体介质反应体系目标产物积累最大浓度,或合成产率提供数据;加之更需要有最后从液体反应混合物采用合适分离手段,得出分离目标产物的收得率,为中间试验提供“下游工程”设计数据)。

5.如何提高实验研究过程工作质量?

从文献调查看来,日本学者在茶氨酸酶法合成实验研究过程是比较理性且合乎逻辑;即使太阳化学公司取得酶法工业开发L-茶氨酸的初步成功,但是仍然存在有如前述的缺陷,即酶活力低,副产物问题,及时停止生产线运作。

先期(1998)文献报道利用硝基还原假单胞菌(IFO 12694)整细胞催化谷氨酰胺和乙胺合成茶氨酸(47g/L),酶活力界定为谷氨酰胺酶(GLS,EC 3.5.1.2)。现在看来,这在一定程度上误导了后继跟进研究者,都把目光聚焦于硝基还原假单胞菌或假单胞菌属的菌种,包括日本太阳公司专利文献(2003)也同样追踪香茅醇假单胞菌整细胞催化合成茶氨酸(40g/L);对其细菌GLS基础酶学性质及其催化特性还未能充分认识其复杂性;通常浅层次理解为该酶就是将谷氨酰胺水解成为谷氨酸和氨。但是不少的谷氨酰胺酶类,比如从谷氨酰胺或谷胱甘肽作为g-谷氨酰基供体催化转移到g-谷氨酰受体,演发出2种谷氨酰转移酶,D-谷氨酰转移酶(EC2.3.2.1)和g-谷氨酰转移酶(= g-GGT,EC 2.3.2.2)。另一方面,要在多种谷氨酰基转移酶类水解供体,即在GLS和g-谷氨酰转移酶(=g-谷氨酰转肽酶,g-GGT)之间,区分清楚必然的相似性,至今也是模糊不清的。以至于早在(1971)有关谷氨酰胺酶类和g-谷氨酰转移酶类综述文献就把这些酶类分为四类:(A)仅有水解作用;(B)水解反应先于与一些受体的转移反应;(C)先有转移反应而后有水解作用(水解反应多被合适的受体所抑制);(D)仅只有转移反应(=转肽酶反应)。可见,细菌的谷氨酰胺酶类和g-谷氨酰转移酶类的基础酶学研究还是不够充分的,导致应用研究(工业生物催化)必然呈现不确定性;可以推断利用谷氨酰胺作为原料,和乙胺经由GLS和/或GGT 酶法合成制茶氨酸在技术-经济性上是不可行的。

虽然g-GGT自从2002年起开始正式报道用于酶法合成茶氨酸,一度形成该技术途径的研发热点,宣讲的突出优势包括不需要ATP再生体系,重组菌产GGT显示很高的活力,并对该酶结合应用小泛素相关修饰(SUMO)融合技术于g-GGT的表达纯化,预示有潜力用于L-茶氨酸的工业生产。但是如不进一步如何提高酶法转化生成茶氨酸的GGT酶活力,克服自转肽生成副产物的缺点,以及缺乏配套的下游工程分离技术降低成本等问题,不言自明,这就是我国首个利用价位高昂底物谷氨酰胺-GGT酶法生产L-茶氨酸仓促推上工业生产线归于失败的原因。

日本学者文献报道至2009年酶法合成茶氨酸技术途径已达到实验研究较高水平。同期或稍后国内的跟踪性实验研究工作也做了不少工作。到如今国内的研发工作可以说基本上都集中在4种微生物酶类具有酶法合成茶氨酸的能力,即谷氨酰胺酶(GLS),g-谷氨酰转肽酶(GGT),谷氨酰胺合成酶(GS),以及g-谷氨酰甲胺合成酶(GMAS)。

前2种技术途径鉴于微生物基础酶学研究薄弱,机理不清楚,加之底物谷氨酰胺价高(与谷氨酸比)应于放弃,不宜继续研发;GS技术途径建议开发利用谷氨酸和氨,结合酵母发酵的ATP再生体系,开发GS技术途径生物制造L-谷氨酰胺(L-Gln)产品也同样在我国具有可观的开发前景。可以延伸国产发酵工业百万吨级低值谷氨酸(钠,味精)产业链,成为如同酶法产茶氨酸一样的高值生物制造产品—谷氨酰胺。

据笔者看来,估计g-谷氨酰甲胺合成酶酶法合成路线比较有竞争力。因为我国幅员广大,生态环境复杂多样,定向富集分离专性甲基营养菌株并非难事,我所应用微生物学科在这一方面有比较好的C-1微生物代谢研究工作基础。选择出酶活/酶量均佳,且操作稳定性好的野生型菌株,结合工业微生物传统和/或细胞分子改造手段改良菌种,实现高性能的生物催化剂制造和有效使用《生物制造》技术体系是可操作的;从而达到酶法合成生物制造L-茶氨酸的生物化工项目从技术-经济学角度评估是可行的,如果研发工作做到位,它与化学法工艺产品比较,显然是具备竞争能力的。

6.如何选准小试研究成果进入中间试验,避免科技投入归于失败?

如标题所示,为什么酶法合成茶氨酸研发或生物制造项目在国内卡壳,其根本原因在于不规范粗糙低水平的应用基础实验研究,急于上生产线进行产品开发。说白了,就是中高层科技行政官僚及“高学历”领军人才对于生物制造R&D的工程概念模糊,对于小试中试阶段科研成果鉴定,在缺乏资格的专家参加评估,不搞“五湖四海”,由小圈子内的行政官员包办,急于求成争功,结果失败成为必然。

参考东瀛学者在茶氨酸实验研究工作上数十年来合符逻辑的科学研发历程,也许对我国学人有借鉴启迪意义,现在将此研发历程列表如下:

年份     研究工作内容                             文献

1949     首次从日本绿茶茶叶发现一个新的      日本科学杂志(日文)

酰胺化合物—L-茶氨酸                1949,23,262-267

1986     借助偶联面包酵母制剂和细菌GS产生g-谷氨酰甲胺和g-谷氨酸乙胺      

J.Gen.Appl.Microbiol., 1986,32,545-54

1992      首次报道海洋甲基营养菌AA-30菌株的-谷氨酰甲胺合成酶                                                      1992,B.B.B.,56(5),708-711

 2004              假单胞菌Y-30酶的纯化表征,并偶联面包酵母成醇发酵GS酶法产茶氨酸                           2004,B.B.B.,68,                                                                         1887-1897

 2005              假单胞菌Y-30菌株GS酶由谷氨酸和氨偶联面包酵母发酵能量转移产生茶氨酸                      2005,B.B.B.,69(4),784-789

 2006              假单胞菌Y-30菌株GS酶基因克隆在E.coli表达,产酶能力胶原菌株高30倍,借助偶联发酵能量转移可产生茶氨酸                                             2006,B.B.B.,70(2),500-507

2007               专性甲基营养菌的分离Met.mays NO。9,其酶被推断为

           g-谷氨酰甲胺何处酶(g-GMAS)     2007,B.B.B.,71(2),545-552

2008        NO.9菌株g-GMAS酶基因克隆,GMAS的氨基酸序列与推定的甲基营养菌Methylobacillus flagellatus KT谷氨酰合成酶(GS)III型有一定程度类似性;在E.coli表达的GMAS酶较原菌株活力高23倍,该酶可用于由谷氨酸和乙胺偶联成醇发酵产茶氨酸。

                                                                                 2008,B.B.B.,72(1),101-109

2008        NO.9菌株g-GMAS酶催化实现在优化反应条件下转化谷氨酸钠和乙胺生成茶氨酸积累浓度达110g/L;并表明高浓度乙胺(>900mM)抑制酵母/糖发酵过程;借助增高液体反应混合物中磷酸钾缓冲液浓度可解除乙胺的抑制效应。

                                                                                    2008,B.B.B.,72(5),1206-1211

2009        应用膜包封g-GMAS的酶管式生物反应器,伴同干酵母细胞发酵能量转移体系,在6批序列生物催化反应中,以100%转化率110g/L

                           茶氨酸产率达到酶法合成茶氨酸的最高水平。

                                               2009,B.B.B.,73(12),2800-2802

7.如何评估中间试验成果进入工业规模试生产阶段?

有鉴于此,笔者针对生物制造产业发展过程的阶段性,提出技术研究阶段着重考察生物催化剂的高效及转化制备合成的稳定性和可重现性(至少5-7批合格样品);中间试验阶段要有完整的技术-经济学评估数据资料,对于微生物酶法转化项目,评估的指标或要求可参考如下条款:

¨    生物催化剂制造成本

¨    原辅材料成本

¨   能源消耗(水电煤或气)成本

¨  设备折旧(12年计算)

¨  车间员工工资福利

¨  边际成本

8.小结

1)中国学者在茶氨酸的酶法合成实验研究领域,确实须得向东瀛同行或同工虚心认真学习合乎逻辑的科学研究工作程序,提高实验研究工作质量;克服浅层次跟风“蜻蜓点水”式发散型研究方法。

2)鉴于当下涉及茶氨酸的酶法合成5类微生物酶基础酶学研究的复杂性,有必要深入表征这些酶的晶体结构,进一步明晰底物乙胺结合,以及通过g-谷氨酰基转移或与L-谷氨酸连接酶法催化合成L-茶氨酸的分子机理,以便借助精准的定向进化技术,提高酶法转化对乙胺的“三性”水平,即底物特异性,催化活性及操作稳定性。

3)迄今为止,g-谷氨酰甲胺合成酶(g-GMAS)技术途径合成L-茶氨酸有较高的技术-经济性,有希望在进行了公斤级中间试验后,经评估进入工业规模开发;至于ATP再生系统,除了已经使用的活性干酵母发酵糖的ATP再生体系外,再进一步研制高效的ATP再生系统,如已经报道的多聚磷酸盐激酶,乙酰磷酸激酶等都是可用于ATP再生。

4)谷氨酰胺合成酶(GS)技术途径酶法转化谷氨酸钠和氨或氯化铵,结合ATP再生系统研制生产谷氨酰胺(L-Gln)也很有必要;此外,谷氨酰甲胺合成酶(GMAS)研发利用谷氨酸和甲胺,结合ATP再生系统产谷氨酰甲胺(GMA);或者谷氨酰转肽酶(GGT)途径酶法转化谷氨酰胺和甲胺产GMA均有酶法合成开发生理活性物质GMA的重要价值。

5)借助生物信息学的基因挖掘技术,从天然源筛查和表征更多具有催化L-茶氨酸合成功能的酶源菌株;结合酶基因克隆和遗传重组技术,期望实现更加有效的技术-经济可行的酶法合成茶氨酸创新工艺。

上述几点就是笔者对国内外有关酶法合成茶氨酸生物制造研发项目,经过文献调查,结合国内过去近20年来茶氨酸酶法合成研发历程及现状所得到的印象,提出个人的见解。评议不够准确或观点不正确的地方,请批评指正。

 
关键词: 茶氨酸

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