诱变技术及其在获取生物表面活性剂高产菌中的应用
推广 热搜: 万古霉素  谷氨酸发酵  发酵  蛋白酶  维生素  酵母  阿维菌素  发酵罐  柠檬酸  菌种 

诱变技术及其在获取生物表面活性剂高产菌中的应用

   日期:2015-03-04     来源:网络    浏览:464    评论:0    
核心提示:诱变技术被广泛用于微生物发酵工业、作物育种等方面,并卓有成效,但是,这些方法难以克服传统诱变育种技术中存在的突变不定向、效率低、性质不稳定、有益突变率低等缺点。微生物诱变育种工作量大而成功率低,且传统诱变剂的反复使用,很多工业生产菌株对其产生了耐受性,同时,无论是物理诱变所用的各种辐射源还是化学诱变药剂对人体基本上都有致癌、致突变和致畸等远期效应,因此这些传统的理化诱变剂在其制备、运输、存储及实验操作等实际应用中存在诸多不便。可以通过寻找安全有效的诱变剂或诱变方法来部分取代传统的诱变剂及诱变方法,如低温等
  
 1  诱变技术及其在获取生物表面活性剂高产菌中的应用
1.1  物理诱变
物理诱变是使用各种射线对微生物进行诱变操作。效果较好、应用较广泛的是x射线、β射线、γ射线、中子和紫外线。其诱变机理主要包括物理阶段、物理化学阶段、化学阶段以及生物学效应4个阶段。
由于紫外诱变相对于其他几种射线最易取材,对人体的伤害也最小,一般采用紫外诱变来获得微生物高产菌。宋绍富等对高效驱油菌I进行紫外诱变,培育出代谢性能较好的菌株,发酵液的界面张力可由6.49mN/m降低到5.86mN/m,降低了9.7%。同时,由于诱变的影响,菌液达到最大菌体浓度的时间也缩短了,表明有效诱变后的菌株生长繁殖速度也得到一定程度的提高,这在微生物采油的矿场应用中能够更快收到增收效果,另外,也有利于注入菌与油藏中的本源微生物竞争营养物质。
Mulligan等对B.subtilis ATCC 21332进行紫外诱变,将原菌株培养到对数期并转移大约300个细菌到营养琼脂平板上,然后用短波紫外灯辐射大约35s,照射时间需要预先确定,以保证细胞的存活率在10%~20%之间,再经过一系列的筛选过程,得到产量提高3~4倍多的B.subtilis Suf-1。将诱变菌B.subtilis Suf-1与标记为B.subtilis BGSC IA28的细菌进行原生质体融合,得到诱变菌B.subtilis Suf-1在基因图谱中定位在argC4和hisA1之间。
Raza等对野生菌Pseudomonas putida 33进行γ射线诱变,得到突变株P.putida 300-B,使用不同的疏水性碳源(烃类、植物油提炼厂废物等)对该突变株进行发酵培养产鼠李糖脂,得到最大生物量3.5g/L、最大鼠李糖脂产量为4.1g/L。在鼠李糖脂的生产中铜绿假单胞菌P.aeruginosa是最经常用到的,但由于它对于人类是一种产生细胞毒素的病原体,故而限制了其在工业处理中的应用,而P.putida对人类不是病原体,故而使用它来生产鼠李糖脂具有很大的研究前景。
许多学者尝试开发一些新型物理诱变方法用于微生物诱变育种,并取得了较好的效果。主要包括离子注入,激光及微波诱变。①离子注入:离子注入可引起DNA键断裂,致使大量受体原子移位、重组,形成新的分子结构和基因,从而获得基因突变。该技术能以较小的生理损伤得到较高的突变率、较广的突变谱,因此将有很好的发展前景。目前微生物生产工业上已有用N+注入生产产高级醇低的果酒酵母,但在获得生物表面活性剂高产菌上还未见应用,预测将其应用于获得生物表面活性剂高产菌将是一种很好的尝试。离子注入诱变方法虽然是一种高效的诱变方法,但是人们实践的过程中发现该方法的回复突变率高,因此还需用其他诱变方法巩固诱变效果,以保证菌种遗传性状的稳定;②激光:激光辐射可以通过产生光、热、压力和电磁场效应的综合作用,引起细胞DNA或RNA、质粒、染色体畸变效应、酶的激活或钝化、细胞分裂和细胞代谢活动的改变。不同种类的激光辐射生物有机体,所表现出的细胞学和遗传学变化也不同。这给生物诱变育种提供了有利条件。激光诱变具有能量密度高、靶点小,单色性和方向性好、诱变当代即可出现遗传性突变等特点,因此在工业微生物育种中得到广泛的应用;③微波:微波辐射对生物体具有热效应和非热效应。在这两种效应的综合作用下,生物体会产生一系列突变效应,因而,微波被用于多个领域的诱变育种。Iqbal等对P.aeruginosa S8进行微波诱变,得到能从碳氢化合物中产生高产量生物表面活性剂的突变菌P.aeruginosa EBN-8。该菌生长在含有Khaskheli天然油的培养基中时,表现出原细菌3~4倍的碳氢化合物乳化作用/转化作用。在含有正十七烷的培养基中生长时也观察到鼠李糖脂产量的提高和对碳氢化合物利用的加强。使用十七烷作为碳源,计算原菌株和突变株生长时间和产生物表面活性剂量并进行比较,原菌株的生长时间是在(30±2)℃下培养24d,而突变株只需在37℃下培养20d且产生物表面活性剂量提高了2~3倍。
1.2  化学诱变
化学诱变是使用化学诱变剂与生物体的遗传物质发生作用,并改变其结构,使其后代发生变异的一种诱变方法。实验中发现能引起生物体遗传物质产生变异的化学物质很多,归纳起来有下面几类:①烷化剂:甲基磺酸乙酯(EMS)、N-甲基-N′-硝基-N亚硝基胍(NTG)、N-亚硝基-N-甲基尿烷(NMU)等;②碱基类似物:2-氨基嘌呤、5-溴尿嘧啶(5-Bu)等;③抗生素:丝裂霉素C(MMC)等;④生物碱:秋水仙碱等;⑤叠氮化物:NaN3、Hg(N3)2等;还有一些简单有机化合物及无机化合物也能诱发突变:目前已得到证明的这类化合物有乙酸铅(LA)、四氯乙烷(TTCE)、H2O2、亚砷酸钠(SA)、LiCl等。French等推测乙酸铅的诱变潜能是由于其间接地干涉DNA修复过程,而不是直接导致:DNA的破坏。Gilli等在托里诺所作的一项调查中,存在空气中的一些微粒物质也有致突变作用,如多环芳烃(PAHs)等。
化学诱变剂诱发突变率高,而染色体畸变较少;对处理材料损伤轻,有的化学诱变剂只限于DNA的某些特定部位。但大部分有效的化学诱变剂较物理诱变剂的生物损伤大,容易引起生活力和可育性下降。
Abbas等以P.aeruginosa MM1011为出发菌株,用N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍做诱变剂,在Siegmund-Wagner(SW)平板上筛选到1株鼠李糖脂表面活性剂高产菌P.aeruginosa PTCC 1637,将产量提高了10倍(由1.2 g/L提高到12.5 g/L),核磁共振(NMR)分析以及表面张力测试表明该变异菌株产生的生物表面活性剂与其同源菌是一样的。该生物表面活性剂具有28.0 mN/m的表面张力以及低至9mg/L的临界胶束浓度,与其同源菌相似,变异株也在停滞期产生物表面活性剂。
在Carrera等的两项发明专利中,对B.subtilis ATCC 21332加入诱变剂N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍进行诱变。再进行连续稀释法等一系列筛选过程,最后得到变异株B.subtilis SMS 274,保存号为ATCC 55033,它产生表面活性剂的浓度为2~4g/L,是突变前的4~6倍。
Bacillus licheniformis JF-2菌株是1株地衣芽胞杆菌,能在好氧和厌氧条件下产生生物表面活性剂,并且能生活在含10%的NaCl、温度高至50℃、pH(4~9)的油层环境中,这些特点非常适合用于微生物法提高石油采收率。但和Bacillus subtilis相比,由Bacillus lichenifrmis JF-2产生的生物表面活性剂量却少得多。因此,通过改变B.licheniformis JF-2的性状来增加生物表面活性剂的产量是十分必要的。sung-chyr等在这方面进行了有益的尝试,他们在研究中向2mL的B.lieheniformis JF-2培养液中加入诱变剂N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍(MNNG),随后进行一系列的处理及筛选过程,最后得到1株变异体Bacillus licheniformis KGL11,它产生的表面活性剂的浓度为390mg/L,是Bacillus licheniformis JF-2产生的表面活性剂的12倍,且表面活性剂的种类相同。
Shabtai等在菌体抵抗阳离子表面活性剂CTAB的基础上分离得到1株产聚合生物乳化剂量高的乙酸不动杆菌RAG-1突变体,这株突变菌不但表现出增强的生长速率,同时与原来的菌株相比产乳化剂量提高了2~3倍。另外,在加入氯霉素的静止细胞系统中也观察到生长速率加快及产乳化剂量提高的现象。当对CTAB产生抗性的突变株与对CTAB敏感的未突变株放在同一生长环境下时,发现只有突变株生长,说明对CTAB产生抗性的突变株导致了囊壁的强化产生。这点在数量上可由一个特殊的与细胞有关的胶囊乳化剂酶连接免疫吸收剂实验得到证实。
1株重组菌Bacillus subtilis MI113,由于植入了与产表面活性剂有关的基因pCll2海港lpa14,在大豆残渣的固态发酵中表现出表面活性剂产量的增加。用N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍对其进行诱变,筛选到1株在豆油或它的提取物中能产生8~50g/L表面活性剂的菌株B.subtilisSD901,这是目前已经报道的产表面活性剂量最高的菌株。
1.3  复合诱变
2种或2种以上诱变剂的先后或同时使用,以及同一种诱变剂的重复使用,常常出现一定的协同效应,能够取得更好的诱变效果,但是由于同一诱变剂的重复处理会使细胞产生抗性,使诱变效果下降,故一般选择前面的方式,即复合诱变。微生物发酵工业上如进行复合诱变,往往能取得较好的诱变效果。复合诱变中,物理诱变上多采用紫外诱变和离子注入诱变。化学诱变剂中烷化剂甲基磺酸乙酯最为常用,而N-甲基-N′-硝基-N亚硝基胍是目前已经发现的效果最为显著的诱变剂。
刘七等以原油为碳源进行微好氧培养筛选到1株产生生物表面活性剂的兼性厌氧菌I,其可将界面张力由16.36mN/m降到6.49 mN/m。以其为出发菌株,经过紫外和甲基磺酸乙酯复合诱变,得到1株性能优良的变异新菌株,可将界面张力从6.49mN/m降低到4.36mN/m,降低了32.8%。该菌株能在较大的pH范围内生长,最高生长温度是72℃,最高耐受盐度为30%。有望用于微生物采油研究。
沈薇等以产糖脂类生物表面活性剂的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)BS-03为出发菌株,对其进行UV和UV+LiCl的诱变,筛选得到1株产量提高了1.658倍(由4.1g/L提高到6.8g/L)的菌株LY4。
Koch等用转位子Tn5-GM和抗生素作为诱变剂,对P.aeruginosa PG201进行诱变。他们将P.aeruginosa PG201于43℃下在LB培养基(Luria broth)中培养24h,进行一系列处理后,在含有庆大霉素(抗生素)的LB琼脂培养基上于30℃下培养,收集24h后出现的菌群并转移到新鲜的含有庆大霉素的LB培养基中,于30℃下振荡培养一个晚上,对发酵液进行连续稀释后转入含有庆大霉素的LB琼脂培养基中于43℃下培养48h。再进行一系列的筛选过程,最后得到产量提高了2倍多的P.aeruginosa 59C7。
2  诱变技术存在的缺陷及改进
诱变技术被广泛用于微生物发酵工业、作物育种等方面,并卓有成效,但是,这些方法难以克服传统诱变育种技术中存在的突变不定向、效率低、性质不稳定、有益突变率低等缺点。微生物诱变育种工作量大而成功率低,且传统诱变剂的反复使用,很多工业生产菌株对其产生了耐受性,同时,无论是物理诱变所用的各种辐射源还是化学诱变药剂对人体基本上都有致癌、致突变和致畸等远期效应,因此这些传统的理化诱变剂在其制备、运输、存储及实验操作等实际应用中存在诸多不便。可以通过寻找安全有效的诱变剂或诱变方法来部分取代传统的诱变剂及诱变方法,如低温等离子体诱变剂、离子注入诱变及上文提到的激光及微波诱变等。怎样克服缺点、发挥优势,把这些方法与杂交育种、代谢控制育种,特别是基因工程育种相结合,发挥各种方法在获取生物表面活性剂菌种改良中的优点,使诱变技术在获取生物表面活性剂高产菌方面得到大面积推广,是我们今后努力的方向。
 
    发酵工业网微信公众号
     
    更多>同类技术资料
    0相关评论

    推荐图文
    推荐技术资料
    
    网站首页  |  2019年第13期  |  设备维修  |  关于我们  |  联系方式  |  付款方式  |  广告合作  |  网站地图  |  排名推广  |  广告服务  |  积分换礼  |  网站留言  |  RSS订阅  |  违规举报  |  浙ICP备12009778
    Powered By DESTOON