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应用合成生物学策略构建全细胞生物催化剂合成(S)-乙偶姻

日期:2018-12-02     浏览:104    下载:0     体积:1.39M     评论:0    


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李检秀
1, 2 ,陈先锐 1 ,陈小玲 1 ,黄艳燕 1 ,莫棋文 1 ,谢能中 1, 2 *,
黄日波
1, 2 *
(1.广西科学院,非粮生物质酶解国家重点实验室,国家非粮生物质能源工程技术研究中心,广西生物炼制重点实验室,广西
南宁 530007;2.广西大学生命科学与技术学院,亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室,广西南宁 530004) 

摘要 目的:在大肠杆菌宿主中过量表达丁二酮还原酶(DAR),同时构建辅酶 NADH 原位再生系统,利用全细胞高效催化丁二酮不对称还原合成( S )-乙偶姻。方法:PCR 克隆多粘芽孢杆菌( Paenibacilluspolymyxa ) dar 基因,连到质粒 pETDuet-1,转化至大肠杆菌( Escherichiacoli )BL21(DE3),构建重组菌 E.coli BL21(DE3)-DAR;通过 HiTrap TALON 柱亲和层析纯化表达产物 DAR 酶蛋白,测定 DAR 的比酶活和分子动力学参数。在重组菌 E.coli BL21(DE3)-DAR 中构建辅酶 NADH 原位再生系统,协同表达枯草芽孢杆菌( Bacillussubtilis )的葡萄糖脱氢酶(GDH),构建重组菌 E.coli BL21(DE3)-DAR/GDH,并以此重组菌为全细胞生物催化剂,优化催化条件,提高( S )-乙偶姻的产量和产率。结果:获得重组工程菌 E.coli BL21(DE3)-DAR 和 E.coli BL21(DE3)-DAR/GDH。DAR 以 NADH 为辅酶还原丁二酮的米氏常数 K m 、最大催化速率 V max 、催化常数 K cat 分别为 2.59 mM,1.64 μmol/L∙min∙mg,12.3/s,还原丁二酮生成( S )-乙偶姻光学的纯度为 95.86 %,具有较好的催化效率和立体异构体选择性。构建辅酶 NADH 原位再生系统后,重组菌 E.coli BL21(DE3)-DAR/GDH 可高效催化丁二酮合成乙偶姻。在最优催化条件下分批补料,乙偶姻产量达 51.26 g/L,转化率 81.37 %,生产速率 5.13 g/(L∙h)。结论:使用非手性化合物原料丁二酮生产高附加值的手性化合物( S )-乙偶姻,以重组菌为全细胞生物催化剂合成( S )-乙偶姻,不需额外添加昂贵的辅酶,具有较高的生产应用价值。
 
关键词:全细胞生物催化剂; 辅酶再生系统; 丁二酮还原酶; 乙偶姻
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