占米林 阚宝军 张辉 董晋军 许国超 韩瑞枝 倪晔*
江南大学生物工程学院 工业生物技术教育部重点实验室 江苏 无锡 214122
摘 要：
【背景】谷氨酸棒状杆菌的基因敲除系统较为匮乏且效率不高，难以对其进行代谢工程改造，不利于高性能工业菌株的构建及规模生产。【目的】分别采用CRISPR-Cpf1 和Cre/loxP 基因敲除系统对谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032 (Corynebacterium glutamicum ATCC 13032)基因组上的argR 和argF 基因进行敲除，比较两种敲除方法的优缺点，为合理选择敲除系统提供依据。
【方法】特异性重组的Cre/loxP 敲除系统是首先利用同源重组将基因组上的靶基因替换为两端带有重组位点loxP 的kanR 片段，然后由重组酶Cre 识别loxP 位点并发生重组反应，从而去除替换到基因组上的kanR 片段，进一步利用质粒的温敏特性将其消除，从而实现靶基因的敲除。CRISPR-Cpf1 敲除系统是利用Cpf1 对pre-crRNA 进行加工，形成的成熟crRNA 引导Cpf1 识别和结合到靶DNA 的特定序列上并切割双链DNA 分子，通过同源重组作用去除靶基因，基于质粒自身的温敏特性将其消除，从而完成基因敲除的整个过程。
【结果】Cre/loxP 系统可在8N+2 d 内完成N 轮迭代基因敲除，而CRISPR-Cpf1系统可在5N+2 d 内完成N 轮迭代基因无痕敲除，理论上还可以一次对多个靶位点进行编辑，效率更高，但存在同源重组效率较低、假阳性率高等缺点。
【结论】与Cre/loxP 系统相比，CRISPR-Cpf1辅助的同源重组基因敲除方法可省时、省力地实现基因的无痕敲除，理论上还可实现多个基因的同时敲除、总体效率更高，然而编辑效率还有提高的空间。
【背景】谷氨酸棒状杆菌的基因敲除系统较为匮乏且效率不高，难以对其进行代谢工程改造，不利于高性能工业菌株的构建及规模生产。【目的】分别采用CRISPR-Cpf1 和Cre/loxP 基因敲除系统对谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032 (Corynebacterium glutamicum ATCC 13032)基因组上的argR 和argF 基因进行敲除，比较两种敲除方法的优缺点，为合理选择敲除系统提供依据。
【方法】特异性重组的Cre/loxP 敲除系统是首先利用同源重组将基因组上的靶基因替换为两端带有重组位点loxP 的kanR 片段，然后由重组酶Cre 识别loxP 位点并发生重组反应，从而去除替换到基因组上的kanR 片段，进一步利用质粒的温敏特性将其消除，从而实现靶基因的敲除。CRISPR-Cpf1 敲除系统是利用Cpf1 对pre-crRNA 进行加工，形成的成熟crRNA 引导Cpf1 识别和结合到靶DNA 的特定序列上并切割双链DNA 分子，通过同源重组作用去除靶基因，基于质粒自身的温敏特性将其消除，从而完成基因敲除的整个过程。
【结果】Cre/loxP 系统可在8N+2 d 内完成N 轮迭代基因敲除，而CRISPR-Cpf1系统可在5N+2 d 内完成N 轮迭代基因无痕敲除，理论上还可以一次对多个靶位点进行编辑，效率更高，但存在同源重组效率较低、假阳性率高等缺点。
【结论】与Cre/loxP 系统相比，CRISPR-Cpf1辅助的同源重组基因敲除方法可省时、省力地实现基因的无痕敲除，理论上还可实现多个基因的同时敲除、总体效率更高，然而编辑效率还有提高的空间。
关键词：谷氨酸棒状杆菌，CRISPR-Cpf1，Cre/loxP，同源重组，基因敲除
