陆海燕 李佳蔓 孙思凡 章小毛 丁娟娟 邹少兰
（天津大学化工学院 系统生物工程教育部重点实验室 天津 ３０００７２）
摘要 以组氨酸营养缺陷型菌株构建为例，在前期分离、诱变和筛选得到的安琪酵母工业菌株衍生菌株Ｋａ中试用ＣＲＩＳＰＲＣａｓ９系统进行基因修饰。针对菌株Ｋａ为单倍体、ｕｒａ３和对潮霉素Ｂ敏感的特点，构建了以ＵＲＡ３为选择标记的Ｃａｓ９表达载体ＹＣｐｌａｃ３３Ｃａｓ９、以ｈｐｈＮＴ１为选择标记的ｇＲＮＡ表达载体ｐＲＳ４２ＨｇＨＩＳ１，使用ＰＣＲ方法合成ｄｏｎｏｒＤＮＡ片段。使用醋酸锂法制备感受态细胞Ｋａ（ＹＣｐｌａｃ３３Ｃａｓ９）、将ｐＲＳ４２ＨｇＨＩＳ１和ｄｏｎｏｒＤＮＡ共转化，涂布（ＣＭＧＵＲＡ ＋３００μｇ／ｍｌ潮霉素Ｂ）平板，经表型筛选和ＰＣＲ产物测序证明筛选平板生长菌落为目的转化子Ｋａ（ｈｉｓ１）的比例为７４．４％，初步建立了适于利用ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统进行基因修饰的工业菌株宿主平台和相应的简便、快速进行基因修饰的操作技术流程。
关键词 酿酒酵母 ＣＲＩＳＰＲＣａｓ９ ｈｉｓ１ 基因敲除
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