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烟酰胺磷酸核糖转移酶在大肠杆菌中的表达及催化合成烟酰胺单核苷酸

日期:2021-03-07     浏览:212    下载:0     体积:1.37M     评论:0    


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 摘要:烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nicotinamide phosphate ribose transferase,Nampt)是生物酶法合成烟酰胺单核苷酸(Nicotinamide ribotide,NMN)中重要的酶,催化烟酰胺(Nicotinamide,NAM)和磷酸核糖焦磷酸(Phosphoribosyl pyrophosphate,PRPP)合成 NMN。 本研究将来源 Meiothermus ruber 的 Nampt 在大肠杆菌系统进行胞内表达,表达产物经纯化后进行酶学性质分析,并进一步将其用于 催化合成 NMN。将重组菌株在 16 ℃低温下进行摇瓶水平诱导 21 h,收集发酵菌体并进行超声破碎,破碎后上清利用 Ni-NTA 螯合亲 和层析的方法进行纯化,SDS-PAGE 结果显示表达与纯化后的产物大小约 55 ku,与预期的蛋白分子量相符。重组 Nampt 的最适反应 温度为 45 ℃,最适 pH 为 6。酶动力学分析显示,该酶对底物 NAM 催化的 Km、Vmax、kcat分别是 0.39 μmol/L、3.20 μmol/(mg·min)、 1.39 1/s。使用该酶催化生产 NMN,通过反应中补加一次底物 PRPP,反应 10 min 产物 NMN 产量可达 30 mg/L。本研究成功表达一 个酶学性质和热稳定性优良的 Nampt,并将其应用在单酶催化生产 NMN 时有较高的产量和生产效率,为生物酶法合成 NMN 的应用 研究奠定了基础。

关键词:烟酰胺磷酸核糖转移酶;烟酰胺单核苷酸;大肠杆菌 
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