胞苷合成途径改造对大肠杆菌嘧啶核苷发酵的影响

  
刘益宁1, 秦臻1, 李旋1, 蒋帅1, 吴鹤云2, 谢希贤1,3* 

1(天津科技大学 生物工程学院,天津,300457) 
2(天津科技大学 食品科学与工程学院,天津,300457) 
3(代谢控制发酵技术国家地方联合工程实验室,天津,300457) 

嘧啶核苷包括尿苷和胞苷,是生产抗病毒和抗肿瘤药物的重要中间体。为获得胞苷高产菌,该研究以高产尿苷的大肠杆菌UR6为出发菌株,利用CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术对其进行了一系列的代谢工程改造。结果显示,cdd、cmk和ygdH 3个基因的敲除阻断了胞苷及其前体物的主要降解途径,使胞苷产量达到了2.8 g/L,而尿苷产量基本无变化;突变体PyrH_ecj(D93A)和PyrG_cgl(D160E、E162、E168K)的引入结合nudG基因的双拷贝有效增强了胞苷合成途径,使胞苷产量提高至5.6 g/L,尿苷产量降低至9.3 g/L;引入酵母菌的5'-核苷酸酶PHM8使尿苷的产量提高至11.5 g/L,而对胞苷的积累影响不大;乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶和尿苷酸激酶的融合表达,增强了尿苷酸到胞苷的合成通量,使胞苷产量进一步提升至7.2 g/L,尿苷产量降低至8.2 g/L。最终所得菌株可用于胞苷和尿苷联产,具有较好的工业化应用前景。