推广 热搜: 万古霉素  谷氨酸发酵  酵母  发酵  发酵罐  维生素  蛋白酶  胰岛素  柠檬酸  阿维菌素 

微生物源防腐剂ε-聚赖氨酸的研究进展

   日期:2013-02-15     来源:杨旭艳 王爱敏 胡国华    浏览:1184    评论:0    
核心提示:21世纪是追求绿色的世纪,追求健康的世纪,食品安全越来越成为人们关注的焦点。目前,在食品添加剂市场上使用的防腐剂种类很多,
  
 21世纪是追求“绿色”的世纪,追求“健康”的世纪,食品安全越来越成为人们关注的焦点。目前,在食品添加剂市场上使用的防腐剂种类很多,开发安全、高效的生物防腐剂尤其是微生物源防腐剂成为增加市场竞争力,提高经济效益,提高人民生活质量的重要举措。微生物源防腐剂ε-聚赖氨酸就是其中的重要代表之一。

1 ε-聚赖氨酸的结构

ε-聚赖氨酸的化学合成是在1947年首先完成的。化学法合成的聚赖氨酸为α型,其赖氨酸残基之间的酰胺键是由α-氨基和α-羧基缩合而成。1977年日本学者从放线菌培养过滤液中提取出一种含有25-30个赖氨酸残基的同型单体聚合物。这种赖氨酸聚合物是由L-赖氨酸的ε-氨基与另一L-赖氨酸的α-羧基通过ε-酰胺键连接而成的多肽,故称为ε-聚赖氨酸(ε-PL)。

2 ε-聚赖氨酸的性质

2.1 ε-聚赖氨酸的理化性质

2.1.1 稳定性

ε-PL纯品为淡黄色粉末,略带苦味、吸湿性强、略有苦味、溶于水,微溶于乙醇,但不溶于乙酸乙酯、乙醚等有机溶剂。聚赖氨酸具有很高的稳定性。赵娟等[4]研究发现,聚赖氨酸 121℃处理 60 mi n仍具有优良的热稳定性;在 p H4.0-7.5时ε- P L相对抑菌活性高于95%, 但在 pH8.0-9.0时其相对抑菌活性下降约 15%; Na+ 、NH 4 +、Mg 2 - 对ε- P L的相对抑菌活性无影响; 而 Ag+ 、 Fe 2 + 、Cu 2+ 浓度大于0.8 mo l/L时,这些盐离子对供试菌的毒害作用显著于ε-P L的抑菌作用.ε- P L适宜的贮存条件是避光、低温,其稳定率大于97 %。因此,多聚赖氨酸能够承受一般食品加工过程中的热处理,可以随原料一同进行灭菌处理,防止二次污染。

2.1.2 最适pH值 

ε-PL抑菌的最适pH值为5-8,也就是说其在中性和微酸性环境中有较强的抑菌性,而在酸性和碱性条件下,抑菌效果不太理想。这可能由于聚赖氨酸作为赖氨酸的聚合物,在酸性和碱性条件下易分解造成的。

2.2 聚赖氨酸的生物学性质

聚赖氨酸是一种具有抑菌功效的多肽,具有以下特点;(1)安全性高,Fukutome等进行的慢性毒性和致癌性联合试验表明,每日摄取食物的ε-PL含量在6 500μg/g,属于极安全的水平;在20 000μg/g,无明显的组织病理变化,也观察不到可能的致癌性。2003年Hiraki J等用14C标志的ε-PL进行ADME试验(动物的吸收性、分布性、代谢性和排泄性试验)也表明ε-PL的安全性。(2)抑菌谱广,在中性和微酸性环境中对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、酵母菌、霉菌均有一定的抑菌效果,而且其对耐热性芽孢杆菌和一些病毒也有抑制作用。但对酵母菌、霉菌的抑菌浓度要求高,为128μg/mL-256μg/mL。单独使用多聚赖氨酸对枯草芽孢杆菌、黑曲霉抑制不明显,采用多聚赖氨酸与醋酸复合作用对枯草芽孢杆菌等耐热性较强的芽孢菌抑制增强。

3 聚赖氨酸的抑菌机理

传统研究认为,防腐剂的作用机理主要表现在如下三个方面:(1)作用于细胞壁和细胞膜系统,引起细胞的物质、能量和信息传递中断;(2)作用于遗传物质或遗传微粒结构,使遗传性状发生改变;(3)作用于关键酶或功能蛋白,使代谢过程受阻。

1983年,Vaara M.等发现聚阳离子能破坏G-细菌的外膜,并进一步杀死这些细菌。1992年Vaara M.进一步发现,聚赖氨酸是通过吸附到G-细菌的外膜上,释放出大量的脂多糖,破坏细菌外膜,而起到抑菌作用。Shima S., Saka H.等研究发现,防腐剂主要抑制微生物的呼吸作用,导致能量物质ATP和还原物质NADH亏缺,所有合成代谢受阻,活性的动态膜结构不能维持,代谢方向趋于水解,最后产生细胞自溶。

Shima S.等对聚赖氨酸的进一步研究发现聚赖氨酸必须含有10个以上赖氨酸残基才具有抑菌活性,对氨基的化学修饰会降低其抑菌能力。ε-聚赖氨酸通过与细胞膜作用影响微生物细胞的呼吸,与胞内的核糖体结合影响生物大分子的合成。刘蔚等通过细胞损伤实验,研究ε-聚赖氨酸对细菌的抑菌机理。结果表明:当ε-聚赖氨酸作用于菌体细胞后,逐渐破坏细胞结构,最终导致细胞死亡,从而起到抑菌作用。

4 聚赖氨酸的生产

4.1 菌种的筛选

研究发现,大多数ε-PL产生菌集中在链霉菌科几个不同的属和麦角真菌这2类微生物上,且不同菌株的产物其赖氨酸单体数也有所不同。因此利用理化因素对链霉菌进行诱变,从中筛选出有利突变是常用的提高聚赖氨酸产量的方法。

据文献报道ε-聚赖氨酸的合成可能途经赖氨酸代谢支路,最后经聚合酶作用生成。在赖氨酸代谢通路中,存在终产物赖氨酸的反馈抑制,因此选用赖氨酸的结构类似物S-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸(AEC)作为抗性筛选标记可以消除赖氨酸的反馈抑制,抗性物质甘氨酸可以代替D-丙氨酸掺人细胞壁,破坏肽聚糖间的交联,影响细胞壁的通透性。诱变选育了S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸和甘氨酸抗性突变株,发现突变株中99%表现高产。在3 L小型发酵罐中,ε-聚赖氨酸产量为20 g/L,相对于葡萄糖消耗的产物得率为8. 9%,而野生型菌株的ε-聚赖氨酸产量仅为5. 7 g/L。

随着对ε-聚赖氨酸合成机理研究的深入和合成酶基因的定位、克隆和表达,科研人员将采用基因工程手段,构建基因工程菌应用于ε-聚赖氨酸的生产。Hiroshi Takagi等在ε-聚赖氨酸产生菌白色链霉菌IFO14147中发现了一种高分子量(37 kb)隐蔽性质粒pNO33。杨千红等对白色链霉菌B-215进行质粒消除实验,结果表明:质粒消除后的白色链霉菌B-215的发酵液没有抑菌效果,且发酵液中不产生ε-聚赖氨酸。由此认为,ε-聚赖氨酸的生物合成与其产生菌的质粒有关。以pNO33为载体,进行了白色链霉菌IFO14147内酰胺酶基因的克隆与分析。结果显示,内酰胺酶的产生由氨苄青霉素诱导,内酰胺酶是由blaL同源基因编码。β-内酰胺酶基因可用作白色链霉菌IFO14147克隆载体的标记基因。

4.2 发酵生产

目前工业上一般采用白色链霉菌(Streptomy-cesalbulus)作为发酵生产菌株,用合成培养基进行发酵生产,所以发酵的培养基成分,温度,Ph 对聚赖氨酸的产量影响很大。最初用野生的S.albulus346进行发酵的研究中,ε-PL在最优化的培养基中的积累浓度是0.5 g/L。Kahar等论证了利用S.albulus410生产ε-PL中严格控制pH值和葡萄糖浓度的重要性。在ε-PL发酵生产中,培养基的pH值通常会从最初的6.8降到36 h后的4.2,然后96 h内逐渐降到3.2。在pH值低于4.2后,ε-PL开始逐渐在培养基中积累,所以在ε-PL的生产中严格控制pH值是有必要的。pH值的控制分2个阶段,第1阶段为菌体的生长阶段,pH值大于5.0(培养过程pH值自然下降,当低于5.0时,用氨水调节);第2阶段为产物积累阶段,pH值控制在4.0。在发酵过程中,发酵液的葡萄糖浓度控制在10g/L,当葡萄糖浓度低于10 g/L时,流加碳源和氮源(含有80%葡萄糖和8%硫酸铵的培养基),使葡萄糖浓度维持10g/L(一般在48 h后),经过4-7 d的发酵,ε-PL的产率最高达48.3g/L。姜俊云等采用5L自控式发酵罐研究了ε-PL分批发酵过程中搅拌转速和pH对发酵指标以及菌体细胞形态的影响。发现提高搅拌速率对菌体生长和ε-PL的合成有显著的促进作用;但当搅拌转速达到400r/min以上时,由于剪切力过大导致细胞死亡,ε-PL产量下降。当pH值维持在5以上,有利于菌体生长;pH值4.0左右可促进ε-PL的合成。搅拌转速350 r/min和控制pH值4.0时可获得最大的ε-PL产量2.95g/L,菌体量9.33 g/L;此时产物ε-PL对葡萄糖的得率和对细胞干重的比生成速率分别为0.062和0.006g/(g·h)。通过对比不同发酵条件下菌丝体的形态变化,发现当菌丝球比较均匀、形态无较大差别、具有致密程度相当的核心时,有利于ε-PL形成。

朱宏阳等利用产ε-PL的菌株Kitasatosporasp.PL6-3进行发酵,当搅拌转速为350r/min,控制pH值4.0并采用初始糖质量分数为3%及补糖时可获得最大的ε-PL产量6.65 g/L,菌体量为6.94 g/L。黄国昌等在50L自控式发酵罐上进行ε-聚赖氨酸发酵条件优化研究,结果表明,当控制pH在5.0以上时有利于菌体的生长,但ε-聚赖氨酸基本不合成,甚至出现降解现象;当pH维持在4.0左右时,能促进ε-聚赖氨酸的合成。搅拌转速为300r/min时,有利于溶氧和传质, 400r/min时,由于剪切力过大,导致菌丝断裂,ε-PL产量下降。通过控制发酵中后期pH4.0和搅拌转速300r/min的pH反馈控制自动流加补料培养,可获得最大的ε-PL产量7.36g/L,产率0.072g/g,产量较优化前提高近10倍,产率提高2倍。但与国外相比,国内的产量还有一定差距。

5 聚赖氨酸的应用

5.1 食品防腐剂

基于毒理学上的研究,聚赖氨酸在日本已经作为多种食品的防腐剂广泛使用。比如,日本学者腾井正弘在米饭中添加0. 4%-0.6%ε-聚赖氨酸-醋酸制剂研究对米饭的防腐作用结果显示: 30℃培养48 h后,添加ε-聚赖氨酸防腐剂的样品中细菌总数为6. 0×103个/g,而空白样中细菌总数为3. 6×108个/g,表明ε-聚赖氨酸-醋酸制剂有明显的抑菌作用。

在国内,对聚赖氨酸的应用处于实验室研究阶段。徐红华等[通过饱和试验设计研究了ε-聚赖氨酸和甘氨酸对牛奶保鲜作用,结果表明单独使用ε-聚赖氨酸和甘氨酸,其抑菌能力明显低于二者混合使用的效果。混合使用时其增效随二者用量的增加而增加;但当ε-聚赖氨酸用量过高时,这种增效作用会有所减弱。其中添加420mg·L-1ε-聚赖氨酸和2%的甘氨酸抑菌效果最佳。程涛等对聚赖氨酸在食醋防腐中的应用进行试验研究,包括聚赖氨酸在食醋防腐中的最大用量、最适用量、聚赖氨酸制剂及其复合防腐剂。试验结果表明:在食醋中单独使用聚赖氨酸效果不明显,当添加聚赖氨酸30mg/kg、EDTA 30mg/kg、山梨酸钾0.4g/kg、纳他霉素30mg/kg作为复合防腐剂时,抑菌率达96%PA上,能有效延长食醋保质期。吕志良等以新鲜玉米为原料,研制成保鲜期可达30d以上的玉米汁饮料。研究表明:玉米汁饮料中ε-聚赖氨酸的最适添加量为30ppm;复合稳定剂最佳配比为蔗糖脂肪酸酯0·1%、卡拉胶0·1%、羧甲基纤维素钠0·2%。

5.2 乳化剂

虽然ε-聚赖氨酸被视为一种天然的防腐剂,但Hiraki通过研究发现,当ε-聚赖氨酸应用到食品加工过程中会与蛋白质和酸性多糖互相作用,从而导致抗菌活性的降低甚至丢失。并且ε-聚赖氨酸的乳化能力又较弱,因此限制了其在淀粉类食品中的应用。

2000年Yu-Ting Ho等通过美拉德反应使ε-聚赖氨酸与葡聚糖结合,改善了ε-PL的乳化活性,ε-PL葡聚糖复合物比其他商品乳化剂具有更强的乳化作用,在NaCl浓度为1.0mol/L的高浓度条件下及碱性环境中,复合物的乳化活性均不受影响;并且,该复合物仍然拥有ε-PL的绝大多数抑菌活性。因此,ε-PL-葡聚糖复合物可在加工食品中作为具有乳化和防腐双功能作用的食品添加剂使用。

5.3 食疗剂

Y-Kito报道了关于脂肪酶抑制剂活性特征及ε-PL对饭后甘油三脂的抑制作用,指出ε-PL能够作用于含有胆盐和磷酸胆碱的乳剂并使其分解,从而抑制脂肪酶活性。可见,ε-PL能够制止小肠对饮食过程中脂肪的吸收,是一种良好的食疗剂。

5.4 医药

ε-聚赖氨酸富含阳离子,与带有阴离子的物质有强的静电作用力并且对生物膜有良好的穿透力,因此多聚赖氨酸可用于某些药物的载体,在医疗和制药方面得到了广泛的应用。解放军总医院基础所的科研科研人员用海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠(APA)微囊化牛嗜铬细胞后(BCC)注入脊髓蛛网膜下,其对慢性疼痛有镇痛作用,而且这种APA膜具有良好的免疫隔离作用。刘彦春等发现以ε-PL包埋的支架对软骨细胞的吸附力明显增强,且细胞分泌基质增多,表明ε-PL不但对细胞有良好的吸附,还有促进细胞发挥正常功能的作用[31]

6 展望

聚赖氨酸具有水溶性好、可直接食用、可生物降解、对人和环境安全无毒等特点,因而在过去几年内聚赖氨酸及其衍生物作为食品防腐剂、乳化剂、生物降解纤维、高吸水凝胶、药物载体、生物芯片等得到了广泛应用。迄今为止, 在日本年产千吨ε-聚赖氨酸的现代化工业装置已建成投产,ε-聚赖氨酸的微生物发酵已实现工业化。美国FDA也已于2003年10月批准ε-聚赖氨酸为安全食品保鲜剂。但该技术在国内总体还处于实验室及中试阶段,因此,必需应用高新技术手段加快对ε-聚赖氨酸的研究,寻求大规模生产ε-聚赖氨酸的发酵条件,实现ε-聚赖氨酸的工业化生产,以适应食品市场的需求。此外,深入对ε-聚赖氨酸和其它防腐剂的复配使用研究,可能会得到更好的抑菌效果,应用范围也将更为广泛。

——摘自2011年FIC(上海)学术论文集,有删节。

 
发酵工业网微信公众号
 
更多>同类技术资料
0相关评论

推荐图文
推荐技术资料
网站首页  |  2021年发酵工业网第1期电子周刊  |  2019年第13期  |  设备维修  |  关于我们  |  联系方式  |  付款方式  |  广告合作  |  网站地图  |  排名推广  |  广告服务  |  积分换礼  |  网站留言  |  RSS订阅  |  违规举报  |  鄂ICP备2024036847号-1
Powered By DESTOON