生物转化一从全细胞催化到代谢工程
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生物转化一从全细胞催化到代谢工程

   日期:2014-05-25     来源:网络    浏览:528    评论:0    
核心提示:生物转化是指利用全细胞或提取酶作为催化剂将底物转化成目标产物的过程。与传统的化学合成方法相比,生物催化的方法可以在低污染、低能耗、高特异性的条件下进行,它可以替换多步化学反应成一步酶催化反应或是引人化合物结构的多样性,所以目前广泛应用在有机溶剂、聚合物材料、医药工业中间体、有机化学光学对映体、抗生素、维生素等重要工业产品的生产中,比如利用微生物细胞生产生物塑料多聚β-羟基丁酸(PHB ) ,药物中间体菇类的生物转化,及紫杉烷类的生物合成等等。
  
     生物转化是指利用全细胞或提取酶作为催化剂将底物转化成目标产物的过程。与传统的化学合成方法相比,生物催化的方法可以在低污染、低能耗、高特异性的条件下进行,它可以替换多步化学反应成一步酶催化反应或是引人化合物结构的多样性,所以目前广泛应用在有机溶剂、聚合物材料、医药工业中间体、有机化学光学对映体、抗生素维生素等重要工业产品的生产中〔}7,比如利用微生物细胞生产生物塑料多聚日-经基丁酸(PHB ) }}},药物中间体菇类的生物转化〔3],及紫杉烷类的生物合成川等等。越来越多的微生物资源被报道应用于生物转化,其研究思路的发展历程,经过了从利用野生型全细胞进行催化,到利用基因工程表达重组酶用来转化,最后进人了组合生物转化和代谢工程的全局性调控阶段。由于具有方向性强、目标明确、可控性好和重现性好的优势,代谢工程在生物转化宿主菌的改造方面具有良好的应用前景,合成生物学的出现又将这种应用提升到了一种多元化的新高度。
1野生菌的全细胞催化
    全细胞催化是指在微生物细胞的作用下,将某种底物转化成特定产物的过程,其实质是生物体系中酶的催化作用。相比提取酶的催化反应,全细胞催化可以利用细胞内的辅因子和其他酶与主反应藕合,降低催化剂的成本并且提高生物催化的效率。这种特定催化作用不仅能够利用自身的底物及其类似物,而且对外源添加的天然底物类似物同样具有催化功能。目前,报道可用于生物催化的野生型微生物细胞表现出了种属的多样性。
1.1放线菌用于全细胞催化
    利用放线菌细胞进行全细胞催化来生产生物活性化合物具有相当长的一段历史。作为胆固醇生物合成途径关键酶HMG-CoA还原酶的竟争性抑制剂,他汀类药物由于具有高效,安全等优点,成为降血脂药物中的首要选择,筛选能够生物合成与转化他汀化合物的菌株一直是他汀类药物开发的关键。在Peng等f57的试验中发现,利用一株分离到的马杜拉放线菌
(ATCC55678)可以将美伐他汀转化成普伐他汀,而后Park等〔6〕又分离到了具有相似转化功能的一株链霉菌( Y-110 ),在连续添加美伐他汀的条件下,普伐他汀的产率可以达到15 m岁L·h。利用链霉菌进行全细胞催化具有广泛的前景,薯祯皂贰元是医药工业中街类药物的重要前体化合物,关于其衍生物的开发具有很好的工业应用潜能,wang等〔,〕从土壤中分离出一株弗吉尼亚链霉菌(IBL-14 ),可以使薯祯皂贰元F一环的C25位叔碳上发生经基化从而生成纽阿替皂贰元型类固醇,这是利用微生物转化薯祯皂贰元生产纽阿替皂贰元型类固醇的最早研究。另外还有利用链霉菌( Streptomyce.s .sauuaueu.si.s MTCC 6637)转化阿魏酸生成香草酸产物〔A]、利用灰色链霉菌(Streptomyce.s gri.seu.s
ATCC 13273)来转化青篙素生成酮类衍生物artemisitone-9 } 9〕等报道。
1.2丝状真菌用于全细胞催化
    近些年来,利用丝状真菌作为全细胞催化剂在工业生产上应用日益广泛,出现了大量丝状真菌转化的报道。街类及其类似物是医药工业领域中的一类重要化合物,关于其关键中间体的研究一直是一个热点,利用粗糙脉泡霉(Neuro.spora cras.sa)可以转化诺酸龙癸醋、皮质醇以及雄街等。Faramarzi等〔io〕发现Neuro.sporacra.s、能够转化雄街1-4-en-3,17-dione成为6种新的代谢产物,其中包括C-6(3 , C-7a , C-9a , C-14a的经基化及C6-C7双键形成,这为街体类药物的研究提供了更为丰富的前体化合物库,进一步为开发新的利尿药物提供了广阔的机会。
    可用于全细胞催化的丝状真菌表现出多样性,例如雅致小克银汉霉(Cuuuiughamella elegau.s)可以转化肾上腺街酮生成5种不同位置经基化产物〔y、胶枝霉属(Gliocladium ro.seum YMFl. 00133)能够选择性经化三菇化合物〔2〕等。
2基因工程微生物全细胞反应
    全细胞催化由于多样性和易操作性的优点在工业上得到了迅速的应用,但是也存在以下几方面的问题:底物跨膜的通透性大小影响最终的转化率;副反应导致底物或产物的降解;存在旁路反应和副产物积累的问题。这些问题一定程度上限制了全细胞转化在工业上的应用,因此利用基因工程异源表达重组酶或对天然酶进行定向改造在生物转化领域得到了迅速的发展。
2.1重组大肠杆菌用于生物转化
    大肠杆菌(E. coli)表达系统是基因工程中应用最早的表达系统,利用E. coli表达外源基因及此表达系统的优化研究已有较多报道,E. coli已成为全细胞催化应用最为广泛的宿主细胞。工业上已用于生产丙二醇、乳酸等重要化工产品〔13],谷胧甘肤、经脯氨酸等药物中间体洲。
    辛伐他汀作为一种洛伐他汀的半合成化合物,在治疗高胆固醇血症上具有很好的应用前景。X1。等〔15]报道了利用全细胞催化从洛伐他汀主环一步转化为辛伐他汀的新方法,发现洛伐他汀生物合成基因簇中LovD基因编码的酞基转移酶具有底物的宽容性,在体外可以使洛伐他汀前体的C8位同a一二甲基丁酞-N一乙酞半胧胺硫醋( a-dimethylbutyryl-SNAG )发生酞基转移反应,从而生成辛伐他汀〔ie}。基于此实验结果,他们将LovD基因插人pET28 a表达载体中构建成pAW31质
粒,转化E. coli BI21进行全细胞发酵,通过添加洛伐他汀主环和一种膜通透性的底物a一二甲基丁酞-5-3-琉基丙}} ( DMB-S-MMP)两种前体,可以检测出产物中辛伐他汀的存在,提高前体浓度最高可以达到85%一90 a/o的转化率。之后他们发现一种E. coli酶BioH能够水解DMB-S-MMP成游离酸,明显降低了底物的浓度进而增加了成本,通过构建一株bioH基因缺失的E. coliBI21( DE3)重复上面的实验,结果在12h内99%的辛
伐他汀转化成功,并且降低了底物的添加量,进一步优化了全细胞催化过程〔;>。对于美伐他汀生物合成中的同源酶M1cH,我们课题组已经完成了其克隆并在E.
coli BL21中的表达,初步证实了其体外活性,目前正在构建一个全细胞催化体系,在发酵液中直接添加底物6-经基一6一去甲基monacolin J和酞基侧链转化生成一种具有更优降脂药理活性的他汀类药物huvastatin,并期望最终通过酶的定向进化〔1A〕达到优化M1cH催化活性的目的。
    细胞色素P450酶系广泛存在于各种动植物和微生物细胞中,具有氧化、过氧化或还原不同类化合物的作用,然而细胞色素P450分离后存在低活性的问题,这种加氧作用需要一个氧化还原体系共同参与完成,需要共表达能量藕合体系,所以细胞色素P450在E.coli中真正意义上功能性表达一直是一个难题。Fujii等〔m〕在E. coli中构建表达了不动杆菌属OC4的细胞色素P450酶氧化生产a , ca-alkanediols,这是细胞色素P450酶第一次在E. coli中功能性和稳定性的表达。
Shresth。等〔.n〕成功构建了一种细胞色素P450酶在E.coli中的生物转化体系,将链霉菌属(Streptomyce.speucetiu.s)中细胞色素P450酶的基因CSP4克隆到pET28a上构建成pI}CPS4重组质粒,同时将恶臭假单泡菌(P.seudomouas putida)的假单泡氧还蛋白还原酶C amA基因和假单泡氧还蛋白CamB基因构建成pDuet-CamA-CamB重组质粒,两种重组质粒在BI,21中共表达,相当于引人了类型I电子传递体系,最终成功转化7一乙氧基香豆素生成7_经基香豆素。
    已报道的还包括应用重组E. coli表达外源葡萄糖异构酶来转化D-葡萄糖生产D一甘露醇f=}7、表达木糖醇还原酶基因CbXR生产木糖醇}aa}、共表达:aoA , calA、CalB基因转化丁香酚生成香草醛[.3〕等等。
2. 2重组酵母和真菌用于生物转化
    利用酵母细胞进行全细胞催化具有很长一段历史,其中酿酒酵母(Saccharomyce.s cerevi.siae)和毕赤酵母( Pichia pa.stori.s)应用最为广泛。早在Payne等[.a〕的研究中,将编码乙醇酸氧化酶的基因多拷贝整合人毕赤酵母细胞的染色体从而构建成醇氧化酶I基因获得的Muts表型菌株,在甲醇诱导型醇氧化酶I启动子的调控下,乙醇酸氧化酶得到高表达,高密度发酵中添加经乙酸4. 5h后检测到98%的乙醛酸生成,利用这个全细胞体系成功地将经乙酸氧化成乙醛酸而省去了费时并且昂贵的蛋白纯化过程。SBUPT'Za}fP等〔=5〕将马铃薯的蔗糖合酶I基因、u.s I克隆到Saccharomyce.s cerevi.siae细胞中,能够转化D型或L型酮糖、醛糖生成不同的蔗糖类似物。通过对、u.s I进行点突变(S11A)进一步扩大了底物范围,为工业生产蔗糖类似物开拓了思路。
    Hond。等[ae〕将尖泡镰刀菌(Fu.sarium oxysporum)的内醋酶基因克隆到米曲霉中进行表达,重组体细胞表现出比尖泡镰刀菌更高的水解活性,加人DL一泛酞内醋溶液4h后,50%的DL一泛酞内醋发生水解,D一构型的外消旋底物完全转化成D-型泛解酸。
2. 3基因改组的应用
    基因改组(DNA shuffling)作为新兴的分子技术越来越多地应用在全细胞催化过程中。利用此技术对野生酶进行定向进化可以显著提高其底物特异性和稳定性。比如联苯双加氧酶因能够转化多环芳香族化合物而被用来降解环境污染物,这种酶由BphAl, BphA2,
BphA3和BphA4四个功能组分构成,其中BphAl编码的是铁硫蛋白的大亚基。Chun等〔a> >将BphA 1经过基因改组后的联苯双加氧酶构建到青色链霉菌(Streptomyce.slividan.s)中,结果发现可以转化黄酮,黄烷酮生成新化合物2,3一二经基黄酮和2,3一二经基黄烷酮,而这种经基化构型可以有效地增强黄酮类的抗氧化作用。阿弗菌素及其衍生物在驱虫药上具有应用前景,而二。C基因编码的酶在其生物合成中起关键作用。Stutzman-Engwall等〔=A〕通过半合成基因改组对二。C基因进行了改造,然后将得到的二。C变异体转人阿维链霉菌(Streptomyce.s avermitili.s}中,通过筛选得到了一株重要衍生物多拉丁克与其他衍生物比值明显提高的菌株(1:0.07),优化该菌株具有很好的工业应用前景。
    除此以外,利用基因改组进行酶的定向进化也应用在一些重要的工业酶中,例如对青霉素酞化酶基因进行基因改组,然后在E. coli中表达,可以显著提高a-内酞胺类抗生素合成中的酞基转移效率〔.9],另外对细胞色素P450进行基因改组从而提升催化活性无疑也
具有强大的吸引力〔30]
    综上所述,利用基因工程表达重组酶用于生物转化已得到广泛的应用,然而在全细胞环境下对单基因或少量基因进行操作仍然具有一定的局限性,因为从分子的角度看,这种操作主要围绕在关键调控酶的过量表达上,但有时增加限速酶的拷贝并不能达到很好的效果,整个代谢途径是在许多不同的酶参与下完成的,控制整个调节途径中酶活性于一定水平来增加主反应代谢流量往往更为有效。另外从细胞的角度看,微生物细胞作为一个整体其内部的代谢途径和生化反应是以网络形式存在的,通过对单独节点的调控往往存在一些问题,比如目的产物产量提升不明显,在这个基础上代谢工程方法得以阐明并在工业生物转化领域得到了应用。
3生物转化中的代谢工程
    近年来,新的‘组学’技术以及计算系统生物学得到迅速发展,基因组测序和宏基因组文库、细胞生物计量学、比较组学、细胞网络重构、细胞芯片等新方法在代谢工程中得到了应用,通过对于宿主细胞遗传信息及外部环境信息的整合分析,可以更精确地改造全细胞的代谢环境从而有利于自身产物的合成或异源转化产物的生成〔31]。早在I}aup等〔32〕通过优化宿主菌来提高D一甘露糖生物转化率的研究中,协同表达甘露糖脱氢酶}MDH)、可以提供NADH的甲酸脱氢酶}FDH) ,
以及有助于底物D一果糖利用的葡萄糖协助蛋白
( GLF ),结果表明经过代谢重构的E. coli可以有效地转化D一果糖生成D一甘露糖。这种通过多基因协同表达或对整个代谢网络及信号转导体系进行分析,从而有目的地对宿主细胞内新陈代谢途径进行改造,最终使整个细胞的代谢环境更加有利于生物转化产物的生成。除了上述模式宿主菌E. coli,代谢工程也应用在改良酿酒酵母sacc人ar。哪ce、。ere:isia。[33Saccharomyce.s  cerevi.siae}  }、黑曲霉
(A.spergillu.s niger)[34}等全细胞生物催化剂的转化效
率上。
3.1代谢流量分析
    1 ,2-indandiol作为抗艾滋病药物的关键前体具有很好的应用前景,然而其工业产率低一直是影响其开发的瓶颈。Stafford等[35〕对红球菌(Rhodococcu.s)的生物转化流量进行研究,成功改造红球菌成为由荀高效生产1 ,2-indandiol的全细胞催化剂。通过提高苟的摄人浓度作为选择压力,即由最初的85 m岁L提升至120 m岁L,筛选到一株副产物1-indenol和1-indanone产生缺陷的突变株ICY 1,利用'" C示踪将这种突变定位在需甲苯诱导的双加氧酶上,由于它的突变阻止了由苟向1-indenol及顺式一(1 S ,2R ) -indandiol的转化,从而流量更多地向单加氧形成(1S,2R)一苟满氧化物并最终水解成目标产物反式一(1R,2R)一indandiol的方向进行,最终产量提高到90 a/o。这种方法也为对于生物催化剂在不明确的生物系统中进行代谢工程指明了方向。最近Chung等〔36〕对代谢工程与代谢流量分析进行了系统综述。
3. 2利用代谢工程生产生物能源物质
    近些年由于非可再生资源的不断消耗,利用微生物细胞生产生物能源成为各国研究者日益关注的领域,而通过代谢工程的手段对宿主细胞进行优化为生物能源的生产带来了巨大机会。Cakir等〔37〕将淀粉以不同的方式加人到分泌枯草芽泡杆菌a-淀粉酶、泡盛曲霉(A.spergillu.s awamori葡萄糖淀粉酶双功能融合蛋白的重组酿酒酵母(YPB-G)的发酵液中,建立化学计量模型分析底物浓度、菌体生长率对产物生成的影响,然后利用流量分配分析不同底物浓度时分批或一批发酵的乙醇生产体系,结果证实此重组菌株YPB-G可以有效地转化淀粉生产工业用乙醇。另外丁醇作为一种乙醇的替代能源由于具有高能函、高疏水性的优点近来引起了广泛的关注,相比乙醇两个碳的增加能够使能函提高40a/o ,Atsumi等〔3A〕通过对异源宿主E. COLL进行代谢工程从而可以高效生产1一丁醇,他们克隆了丁
醇生物合成途径中重要基因thl , hbd , crt , bcd , e典B,adhE2并在E. coli中进行了表达,相当于引人了新的代谢途径,进一步对E. coli中与底物竟争有关的基因ldhA, adhE,和frdBC进行了敲除,使整个细胞环境更有利于异源途径中1一丁醇的生产,为工业上发酵生产1一丁醇提供了新的思路。
3. 3合成生物学与生物转化
    随着各种组学技术及系统生物学方法的阐明,对于全细胞内基因及蛋白调控网络有了深人的了解,异源重构特定代谢产物的合成与转化成为了可能。合成生物学的主要目标是通过工程手段对细胞内精确调控组分,如顺式调控元件进行重构,最终调控细胞行使预期的功能〔39],目前主要应用于工业上污染物的生物转化降解、生物能源的异源催化合成等的过程优化。
    正如前面提及的,单独元件操作往往具有一定局限性,对于全细胞催化剂进行多基因、多组分的网络重构分析具有很好的工业应用前景。恶臭假单胞菌( P.seudomoua.s putida)由于具有代谢通用性,易于进行遗传操作等特点广泛应用在化合物的生产和有害废物的清除上。P.seudomouas putida中许多关键酶应用在如D/L苯基甘氨酞胺的拆分、L-氨基酸的生产等生物催化合成过程中,然而对于其基因型一表型相互关系了解甚少,限制了其在工业上的广泛应用。Puchalk。等〔ao}发展了一种基因组范围内重构恶臭假单胞菌I}T2440代谢网络的方法,基于约束模型对其网络特征进行分析,并根据从各种生物信息数据库、发表文献得到菌株最新的基因组学信息、生化生理特性进行网络重构,基于最初的数据收集导致模型第一次重构iJP815'"P',添加反应优化模型成iJP815'"P_,然后利用不同底物消耗测定来对模型进行完善。他们发现其中877个反应与
886个代谢产物的形成有关,只有6%的反应是非基因相关的,这种重构过程有利于描述代谢网络中的基因功能。最终利用底物消耗测定(BIOLOG)、代谢流的13c放射性测定、及特异性产生一系列突变株的方法对这种模型进行了验证,成功地将这一模型应用到利用恶臭假单胞菌转化生产3-经基丁酸盐一3-经基戊酸盐(3HB-3HV)等多经基烷烃化合物上。随着研究方法的发展,合成生物学的研究领域不断得到扩充,利用合成生物学来改造工程菌、生产人工原始细胞及合成基因组、开发细胞代谢途径调控的芯片模型成为了一种新趋势,合成生物学的发展将会给整个生物科学界带来一场革命。
4展望
    美国国家研究委员会预测,到aoao年,将会有so%的有机化学品和材料产自生物质,而生物转化将起到核心作用。在医药领域中,只有通过采用低成本技术和同化学的紧密结合等方式才能发挥生物转化的最大应用潜能,化学方式目前仍然是生产医药化合物的主要手段,但是通过生物催化可以扩大目的化合物的复杂性,这反过来又为化学方式开拓了更多新方向,除此之外,这种“绿色”的方法可以最大程度地降低对环境的污染,在一定程度上能够达到经济效益和环境保护的双赢局面。
    随着基因组学、转录组学、蛋白组学及近来产生的代谢组学的迅速发展,生物转化的基础研究和应用研究将会得到更快的发展,全局性代谢工程、合成生物学等新方法新技术的出现为生物转化的应用提供了更广阔的空间。以生物转化为核心的工业生物技术将是生物技术革命的下一个浪潮。
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