1材料和方法。
1.1实验材料。
1.1.1菌种。
两歧双歧杆菌（Bifidobacteriumbifidum）F235，由无锡轻工大学食品微生物实验室提供。
1.1.2培养基。
发酵培养基：蛋白胨2.0g，葡萄糖1.0g，酵母汁0.5g，牛肉膏0.5g，K2HPO40.3g，HCl2半胱氨酸0.1g，蒸馏水100mL，pH值调至7.0，0.7×105Pa杀菌15min.计数培养基：MRA.1.2实验方法。
1.2.1冷冻干燥制备活菌粉剂工艺流程。
活化菌种→液体培养→菌体收集→细胞悬浮液→冷冻干燥→活菌粉↑保护剂
1.2.2细胞悬浮液的制备。
液体培养基中培养好的菌液在冷冻离心机中离心收集的菌泥悬浮于原体积1/10的生理盐水中，最终菌体浓度为108～109个/mL.1.2.3冷冻干燥。
将悬浮液按0.5mL/份分装于灭菌瓶中，分别加入不同的保护剂后，放入冷冻干燥机，于-35～-40℃下预冻1～2h，然后在真空度10.67～12.00Pa条件下干燥约30h左右，直到样品的温度达到室温为止。
1.2.4储存实验。
冷冻干燥后的菌粉立刻取样测定活菌数，其余抽真空和蜡封，以隔绝空气并防止水分变化，然后分别储存于（4±0.5）℃和（25±0.5）℃的恒温培养箱中，每隔一段时间取出计数。
1.2.5活菌数测定。
采用平板计数法，39℃下厌氧培养48～72h，计平板上的菌落数。
1.2.6存活率的测定。
取待测菌粉0.2g，加入一定量灭菌PBS缓冲液，室温静置复水20min，再进行活菌数测定。
干剂中菌的存活率=瓶内干剂复水后活菌数瓶内原有双歧杆菌悬浮液的活菌数×100每克活菌粉的双歧杆菌活菌数=瓶内干剂复水后活菌数干剂的重量2结果与讨论。
2.1保护剂对双歧杆菌冷冻干燥存活率的影响。
2.1.1不同保护剂对双歧杆菌冷冻干燥存活率的影响。
有关冷冻干燥过程中保护剂对细胞的影响已有相当多的研究，保护剂大体上可分为2类，一类为低分子化合物（如糖类，醇类和氨基酸等），另一类为高分子物质（如蛋白质，可溶性淀粉等），一般来说前者发挥直接保护作用，后者促进前者的保护作用[4]。如所示低分子化合物的保护剂又可分为：①酸性物质；②中性物质；③碱性物质。第⑥类的各种物质是为了防止对冷冻干燥菌有害的胺基羰基反应或氧化作用而添加的。原则上低分子化合物有效配合高分子物质就能获得良好效果，但并非每种保护剂对所有的微生物都有保护作用，由于细胞结构和大小的差异，对于不同微生物，即使采用相同的保护剂所取得的效果也是不同的，这就要通过实验来确定。
据资料报道[5]，淀粉和蛋白类物质同双歧杆菌相混合能起到保护层作用，本实验将3种典型的大分子保护剂应用于双歧杆菌，结果见。
微生物的冷冻干燥保存所用的保护剂①酸性物质天门冬氨酸，谷氨酸，苹果酸，乳酸②中性物质葡萄糖，乳糖，蔗糖，棉籽糖，海藻糖，山梨醇，DL2苏氨酸，肌醇，木糖醇③碱性物质精氨酸，组氨酸④高分子物质及其分解产物白蛋白，动物胶，粘液蛋白，各种胨，肉汁，酵母汁，可溶性淀粉，糊精，海藻酸，果胶，阿拉伯胶，葡聚糖，聚乙烯吡咯烷酮（PVP），羧甲基纤维素（CMC），藻类⑤天然的混合物脱脂乳，血清，脱纤维蛋白血液⑥其它抗坏血酸，半胱氨酸，羟胺，胺基脲大分子保护剂对菌体存活率的影响保护剂存活率/不加<110麦芽糊精9.210可溶性淀粉17.220脱脂奶粉40.2注：菌液与保护剂体积比为1：3.从表中可以看出，这些大分子物质能显着的提高菌体存活率，其中以20脱脂奶粉效果最佳。近几年来有研究表明，海藻糖具有稳定细胞膜和蛋白质结构，抗逆保鲜的作用，在生物保藏方面有着其它保护剂不可比拟的优势[6]，但目前国内尚未工业化大规模生产海藻糖，考虑到经济效益和实验条件，本研究中未加采用。双歧杆菌曾归类于乳酸菌属[7]，它们之间有许多相似的性质，据资料报道蔗糖，甘油，谷氨酸和明胶对乳酸菌具有一定的保护作用[3，8]，因此本文在20脱脂奶粉的基础上加入不同的保护剂，对双歧杆菌冷冻干燥存活率的影响见。
可以看出，保护剂的加入对冷冻干燥双歧杆菌的存活率具有重要的作用，其保护机理可从以下几方面来认识：
（1）冷冻干燥对菌体造成的伤害Marth[9]综述了菌体在冷冻干燥过程中和贮存期中活力损失的主要原因，其中，冷冻冲击，细胞壁通透性的改变和代谢损伤是最重要的。冷冻冲击可能伴随对细胞膜的伤害或胞内冰晶的形成。水结成冰后，细胞浆中残余部分的溶液浓度会增大，这能引起胞内pH和离子强度的改变以及有害化学反应速率的提高。冷冻伤害还可能引起细胞膜通透性的提高，冻干微生物的代谢活性或酶活可能发生改变[10]。微生物细胞冷冻干燥过程中所受的伤害与表面相关[11]，Morichi[12]认为在冷冻过程中，盐浓度的增加使细胞表面或附近的蛋白质发生变性，因而改变细胞膜，包括透酶系统的部分和潜伏的降解酶的抑制物，抑制物的释出导致降解酶的活性增加，在受伤细胞中表现出代谢损伤。
（2）冷冻干燥时影响菌体死亡率的关键因素[13]冷冻干燥中微生物死亡的可能性表达为：P=∫sρsdSP：微生物死亡的可能性；S：微生物暴露于外界培养基的区域；ρs：可能发生于细胞壁的损伤密度。
当细胞的生理条件和胞外环境没有改变时，则ρs为常数。因此上式可变为：P=ρsS上式说明微生物死亡的可能性与暴露于外部的区域及细胞膜的通透性有关，也就是说影响上述2因素的冻干条件都会影响到菌体的死亡率。菌体暴露于外部的区域受菌体浓度，悬浮液浓度，保护剂等的影响，而细胞膜的通透性受菌龄，冻结速度，干燥速度，保护剂等的影响，因此上述因素都可能影响到菌体的死亡率，其中以保护剂的作用最为复杂。
（3）保护剂的作用保护剂的保护作用与它们的化学结构有密切关系[3]，如甘油，低分子糖和醇等，它们具有5个以上的羟基，可以与菌表面自由基联结起来，避免菌体暴露在介质中，还可与蛋白质形成氢键以取代水，保证了蛋白质的稳定性；在溶液中它们易结合水分子，发生水合作用，减少了游离水的含量并增加了溶液的粘性，从而减缓晶核的生长过程，使形成的冰晶较细小，以达到保护细胞的目的。脱脂奶粉，可溶性淀粉等高分子保护剂，能溶于水，溶液可呈过冷状态，即在冰点以下的相同温度下该溶液中的溶质（电解质）浓度较小，蛋白质的盐析变性也较少，另外，它们能减少细胞暴露于氧气和介质中的面积，同时在菌体表面形成保护层，减少由于细胞壁损坏而引起的胞内物质泄漏，从而起到保护作用。
从中可以看出，脱脂奶粉的效果较好，这是因为在干燥时，乳清蛋白能在菌体外形成蛋白膜，对细胞加以保护，并可以固定冻干的酶类，防止由于细胞壁蛋白质损坏而引起的胞内物质泄漏，而且乳中其它成分（如乳糖等）同样可提高菌体的冻干存活率。其它几种物质只起到保护层的作用，故效果不如脱脂奶粉好。
实际上，从，3可看出，不同的保护剂各有优缺点，单一保护剂不能满足菌体抵抗外界恶劣的条件，以一定比例复配的保护剂效果较好，其中以脱脂奶粉与蔗糖，甘油复配后的保护效果最佳，这是因为3者具有互补作用，脱脂奶粉主要在细胞表面起保护层作用，甘油能渗透到细胞内部[14]，冷冻时加入甘油后将发生如下变化：①冲淡溶液中溶质（盐）浓度，细胞摄入盐量减少，由保护剂替代；②保护剂进入细胞，改变了胞内过冷状态，使胞内压力接近胞外压力，降低了细胞脱水皱缩程度和速度；③保护剂进出细胞容易，缓解了复水时渗透性肿胀引起的损伤。在干燥过程中蔗糖形成一种玻璃态，在玻璃态下粘度极高，因而分子扩散系数很低，使大分子物质的链锻运动受阻，细胞壁的通透性降低，从而起到保护作用。
2.1.2复配保护剂配比的确定。
由于复配保护剂中每种保护剂在冷冻干燥过程中都发挥各自的作用，同时相互间又具有协同作用，它们之间的配比与存活率的关系见。
由可知，随着脱脂奶粉添加量的增加，菌体存活率有所提高，这可能是由于保护层厚度以及菌体细胞被覆率的增加，使菌体表面暴露于外界的区域进一步减少，从而增强了保护作用。
2.1.3菌体与保护剂比例的确定。
任何保护剂只有达到一定浓度时才能起到保护作用，不同的菌体量所需的保护剂的量也是不同的，菌体与保护剂的比例对存活率的影响见。
保护剂的比例与存活率的关系配比/A：B存活率/3：156.31：162.11：368.9A：菌液；B：保护剂。
菌体量与保护剂的比例也会影响存活率，如果保护剂太少，则细胞表面被保护剂所覆盖的程度以及维持细胞中蛋白质结构等的作用不够，这样就可能导致细胞在冻干时暴露区域及细胞通透性较大，从而死亡也较大。
2.2贮存过程中菌体存活率的变化。
双歧杆菌要作为保健因子进行销售或加入其它食品中，必须具有一定的货架寿命。
本文对采用不同保护剂冷冻干燥制得的双歧杆菌粉在4℃和25℃下进行贮存。
而在实际的保存过程中，影响活菌粉剂存活率的因素是极其复杂的。而且在贮存中并非只有热效应带来的影响，其它非热效应作用在微生物上而引起的变化是很难推测的，对于不同的菌都有其自身的死亡规律。依据本试验的结果，并非能用此简单公式来进行预测。
不同保护剂在贮藏中与菌存活率的关系保护剂20NFM20NFM8蔗糖20NFM1甘油20NFM1谷氨酸20NFM8蔗糖1甘油20NFM8蔗糖1.5明胶A0.890.680.780.470.490.70B1.641.211.270.750.770.69A：4℃，90d后减少对数；B：25℃，20d后的减少对数。
从中可以看出，在储藏过程中，采用20NFM 1甘油与20NFM 1甘油 8蔗糖2种复配保护剂保护下的活菌粉剂无论在4℃还是25℃其死亡率相对都较慢，这2种保护剂中都含有甘油，可能是由于甘油是一种具有良好渗透性的小分子物质，它能渗透入细胞内部，以羟基和胞内大分子物质形成氢键，部份取代由水分子形成的氢键，这使得生物体中的蛋白质，碳水化合物，脂肪和其他大分子物质在缺水条件下仍在一定程度上保持其原有结构，维持生物体的活力。
3展望。
由于冷冻干燥对细胞的损伤小，它是目前在菌体干燥保存中应用最为广泛的一种干燥方法，但冷冻干燥过程消耗能量较大，生产能力小，设备成本和维持成本高，这在很大程度上限制了冷冻干燥技术在食品工业中的应用。而喷雾干燥机是食品厂最常用的一种干燥设备，但由于其工作温度过高一般不用于菌体干燥，若将其改造为低温喷雾干燥设备，令其在菌体的可耐受温度下实现干燥过程，这将大大降低成本。另外，双歧杆菌要对人体产生有益作用，首先它必需通过胃环境以大量的存活菌到达肠道并定殖于肠粘膜上，双歧杆菌菌粉虽然较耐贮藏，但在经过胃液时由于胃酸的杀菌作用活菌数会大幅度下降。国内外学者正研究采用微胶囊和涂膜技术对它进行保护，或对它进行优化筛选及基因改进，培养出耐氧性和耐酸性的双歧杆菌，这必将是今后双歧杆菌研究开发的热点。
