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基于莽草酸途径微生物合成芳香族化合物

   日期:2020-02-13     来源:生命科学    作者:江晶洁 1, 刘涛 2, 林双君    浏览:12600    评论:0    
核心提示:芳香族化合物是一类重要的天然产物,在自然界中广泛存在,应用于食品、医药、化工等多个领域,主要通过化学合成、植物提取等方式获得。近年来,随着石化资源减少、人类环保意识的加强,微生物合成芳香族化合物及其衍生物成为热点。莽草酸途径合成的芳香族化合物及其衍生物多种多样。现重点综述通过莽草酸途径合成的“达菲”药物前体莽草酸、大宗化学品己二酸前体顺, 顺-粘康酸、芳香族氨基酸及其他高附加值芳香族氨基酸衍生物的微生物合成研究进展,为建立生产高附加值化合物的细胞工厂提供参考。
  
 
关键词芳香族化合物    代谢工程    微生物合成    
Research progress on the biosynthesis of aromatic compounds by microorganisms
JIANG Jing-Jie 1LIU Tao 2LIN Shuang-Jun       
Abstract: Aromatic compounds are an important class of natural products. They are widely distributed in nature and are used in many fields such as food, medicine, and chemical industry. They are mainly obtained by chemical synthesis and plant extraction. In recent years, with the reduction of petrochemical resources and the enhancement of human environmental awareness, microbial synthesis of aromatic compounds and their derivatives has become a hot spot. The aromatic compounds and their derivatives synthesized by the shikimate pathway are diverse. This review focuses on the advances in the microbial synthesis of shikimic acid (the synthetic precursor of oseltamivir), ciscis-muconic acid (the precursor of the bulk chemical adipic acid), aromatic amino acids, and other high value-added aromatic amino acid derivatives synthesized by the shikimate pathway. This review will provide some advice on the establishment of cell factories for the production of high value-added compounds.
Key wordsaromatic chemicals    metabolic engineering    microbial synthesis    

芳香族化合物是指含有苯环结构的一类化合物总称,存在于煤、石油、植物、藻、真菌和细菌中,在食品、化工、医药和饲料等领域具有广泛的应用。自19世纪中期人们在煤焦油中发现了芳香族化合物后,煤焦油逐渐成为获取芳香族化合物的主要来源。20世纪40年代,以石油为原料,利用化学方法成功制备芳香族化合物,使得石油逐渐成为芳香族化合物制备的另一重要来源。植物是高附加值芳香族化合物的来源。一方面,随着石化资源的过度开发和消费以及人类环保意识的加强,以煤、石油为原料的芳香族化合物及其衍生物的生产方式面临着资源紧缺、手性拆分难、环境污染等问题;另一方面,植物提取受限于资源匮乏,价格昂贵。因此,人们将目光投向微生物合成领域,以探寻绿色环保的芳香族化合物及其衍生物的生产方式。随着基因工程、代谢工程、合成生物学等学科技术的发展,以微生物为研究对象,代谢工程改造及合成生物学方法为技术手段,构建高效的微生物细胞工厂,实现了绿色、清洁、可持续的芳香族化合物及其衍生物的生产[1]

莽草酸途径是微生物合成芳香族化合物及其衍生物的主要途径,但合成产量较低,无法满足日益增长的市场需求。以“进”、“通”、“截”、“堵”、“出”等代谢工程手段,优化莽草酸途径,同时,以合成生物学指导,设计、构建天然和非天然芳香族化合物合成途径,引入一系列生化反应及相关编码基因,其中某些基因是外源生物的,可实现天然、非天然芳香族化合物及其衍生物的生物合成及产量优化[2]。基于此,莽草酸(shikimic acid, SA)、顺, 顺-粘康酸(muconic acid, MA)、芳香族氨基酸及其衍生物的微生物合成研究受到越来越多的关注,这些研究不仅为工业化高产芳香族化合物及其衍生物提供了一种新的、绿色的生产方式,也为处于研究初级阶段的高价值芳香族化合物的微生物高产提供了理论基础和技术方法。本文基于莽草酸途径依赖的芳香族化合物及其衍生物的部分案例,综述近年来在微生物合成天然和非天然化合物方面的研究进展。

1 莽草酸途径

莽草酸途径是芳香族化合物生物合成的主要途径,不仅存在于微生物中,也广泛存在于植物中,但动物中不存在[3]。该途径起始于D-赤藓糖-4-磷酸(erythrose 4-phosphate, E4P)、磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate, PEP),经3-脱氧-δ-阿拉伯糖庚酮糖-7-磷酸(3-deoxy-D-arabino-heptulosonate- 7-phosphate, DAHP)合成酶(DAHP synthase, AroG/F/H)催化,羟醛缩合生成DAHP,其中E4P来源于戊糖磷酸途径,PEP来源于糖酵解途径。DAHP在3-脱氢奎尼酸合成酶(3-dehydroquinate synthase, AroB)作用下去磷酸,分子内羟醛缩合生成3-脱氢奎尼酸(3-dehydroquinate, DHQ)。随后,DHQ在3-脱氢奎尼酸脱水酶(3-dehydroquinate dehydratase, AroD)作用下,脱一分子H2O生成3-脱氢莽草酸(3-dehyd- roshikimate, DHS),最后,莽草酸脱氢酶(shikimate dehydrogenase, AroE)催化DHS生成莽草酸(shikimic acid, SA)[4],伴随着副产物奎尼酸的生成,而奎尼酸多以游离、酯化、生物碱结合等形式存在[5]。分支途径中,DHS经脱H2O、烯醇化反应,可生成原儿茶酸,或脱氢、烯醇化反应合成没食子酸。在莽草酸激酶(shikimate kinase, AroK/AroL)的催化下,莽草酸磷酸化生成莽草酸-3-磷酸(shikimate-3-phosphate, S3P)。S3P在5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸酯合成酶(5-enolpyruvylshikimic acid-3-phosphate synthase, AroA)催化下,与PEP缩合,生成5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸(5-enolpyruvylshikimic acid-3-phosphate, EPSP)。EPSP在分支酸合成酶(chorismate synthase, AroC)催化下,去磷酸形成分支酸(chorismate, CHA)。CHA是芳香族氨基酸L-苯丙氨酸(L-phenyla- lanine, L-Phe)、L-酪氨酸(L-tyrosine, L-Tyr)、L-色氨酸(L-tryptophan, L-Trp)生物合成途径到各分支途径的分支点。双功能酶分支酸变位酶/预苯酸脱水酶(chorismate mutase/prephenate dehydratase, PheA)是L-Phe合成代谢分支途径上的关键酶,其催化预苯酸(prephenic acid, PRE)脱羧、芳构化及脱去基团,生成苯丙酮酸(phenylpyruvate),随后苯丙酮酸经磷酸吡哆醛(pyridoxal phosphate, PLP)依赖的转氨反应生成L-Phe。双功能酶分支酸变位酶/预苯酸脱氢酶(chorismate mutase/prephenate dehydrogenase, TyrA)催化CHA转化生成PRE,进而生成4-羟基苯丙酮酸(4-hydroxyphenylpyruvate, HPP),再通过PLP依赖的转氨基反应生成L-Tyr [6]。CHA经邻氨基苯甲酸合成酶(anthranilate synthase, TrpEG)、邻氨基苯甲酸磷酸核糖转移酶(anthranilate phosphori-bosyltransferase, TrpD)、N-(5′-磷酸核糖)-氨基苯甲酸异构酶(phos-phoribosylanthranilate isomerase, TrpF)、吲哚-3-甘油磷酸合成酶(indole-3-glycerol phosphate synthase, TrpC)和色氨酸合成酶(tryptophan synthase)作用下生成L-Trp (图 1)。

F6P:果糖-6-磷酸;G3P:甘油醛-3-磷酸;PEP:磷酸烯醇式丙酮酸;E4P:D-赤藓糖-4-磷酸;PYR:丙酮酸;RI5P:核酮糖-5-磷酸;R5P:核糖-5-磷酸;X5P:木酮糖-5-磷酸;S7P:景天庚酮糖-7-磷酸;DAHP:3-脱氧-δ-阿拉伯糖庚酮糖-7-磷酸;DHQ:3-脱氢奎尼酸;DHS:3-脱氢莽草酸;SHK:莽草酸;S3P:莽草酸-3-磷酸;EPSP:5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸;CHR:分支酸;L-Tyr:L-酪氨酸;L-Phe:L-苯丙氨酸;L-Trp:L-色氨酸;TktA:转酮醇酶I;PpsA:磷酸烯醇式丙酮酸合成酶;AroF/AroG/AroH:3-脱氧-D-阿拉伯糖-庚酮糖酸-7-磷酸合成酶;AroB:3-脱氢奎尼酸合成酶;AroD:3-脱氢奎尼酸脱水酶;AroE:莽草酸脱氢酶;AroK/AroL:莽草酸激酶;AroA:EPSP合成酶;AroC:分支酸合成酶图 1 莽草酸途径
2 莽草酸途径中间体及其衍生物的生物合成

莽草酸途径是生物合成芳香族化合物的重要途径,也是途径中间体3-脱氢莽草酸、莽草酸、分支酸及其衍生物的合成基础。近年来,基于莽草酸途径,以大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、酿酒酵母等微生物为起始菌株,生物合成天然和非天然芳香族化合物及其衍生物取得了一定的进展,如“达菲”药物合成前体莽草酸、大宗化学品己二酸前体顺, 顺-粘康酸、化妆品活性成分熊果苷等化合物的微生物合成。

2.1 莽草酸

莽草酸是芳香族氨基酸生物合成途径中最早鉴定出来的化合物,也是抗禽流感药物“达菲”(Tamifu)合成的关键手性原料[7-8]。早期,莽草酸原料主要从木兰科东方小型树种结出的果实八角茴香中提取,但产率低,提取率也低。为保证莽草酸的正常供应,代谢工程改造微生物合成途径以实现莽草酸高产的研究备受关注,并取得一定进展。Frost研究组利用L-Trp、L-Tyr营养缺陷型大肠杆菌突变子D2704,对芳香酸合成途径中限速酶进行鉴定,确定AroB、AroK、AroL、AroA为限速酶[9]。随后,通过高表达限速酶AroB、去反馈抑制DAHP合成酶(DAHP synthase, AroFfbr)和敲除AroK、AroL等方法改造大肠杆菌莽草酸合成途径,并获得莽草酸生产菌株,莽草酸产量可达27.2 g/L。为了进一步提升大肠杆菌合成莽草酸的能力,Frost研究组对莽草酸途径起始化合物PEP和E4P合成途径的关键酶进行了过表达,包括转酮酶(transketolase, TktA)、PEP合成酶(phosphoenolpyruvate synthase, PpsA)、来源于Zymomonas mobilis的葡萄糖激酶(glucokinase, Glk)、葡萄糖促进剂(glucose facilitator, Glf),获得莽草酸生产菌株E.coli sp1.1pts/pSC6.090B,经10 L发酵罐分批补料发酵,产量高达87 g/L,转化率约33% [10]。鉴于葡萄糖转运系统(glucose transport system, PTS)利用PEP提供葡萄糖-6磷酸的磷酸供体,而PEP是莽草酸合成途径重要中间体,Bolivar研究组对大肠杆菌BW25113菌株进行PTS系统敲除,同时敲除糖酵解途径中PEP去磷酸酶(phosphoenolpyruvate, PykA/PykF),以提高PEP前体积累,为优化莽草酸合成途径提供了一个新的思路[11]。在此基础上,该研究组利用组成型启动子替代诱导型启动子表达关键基因的策略,对莽草酸合成途径进行了系统的优化,经1-L发酵罐分批补料发酵,莽草酸产量达到43 g/L,转化率达到42% [12]。还原力NAD(P)H在莽草酸合成途径中起到至关重要的作用,刘建忠研究组为提高NAD(P)H胞内积累量,过表达了转氢酶(transhydrogenase, PntAB)、NAD激酶(NAD kinase, NadK)[13]。此外,该研究组将莽草酸合成途径关键基因整合至菌株染色体中,以克服质粒表达的不稳定性问题,成功获得莽草酸生产菌株E.coli BW25113 SA116,经摇瓶发酵,莽草酸产量约3.12 g/L,转化率33%[13]。除了大肠杆菌以外,谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)也可作为莽草酸合成的初始菌株,结合大肠杆菌中莽草酸途径优化策略,Inui研究组在PTS系统敲除菌株中,过表达了Myo-肌醇转运蛋白(Myo-inositol transporter, IolTA)、Glk/Ppgk、磷酸戊糖途径中的Tkt以及莽草酸途径关键酶AroB、AroD、AroE,并同时敲除DHAP代谢途径中的磷酸酶,避免副产物1, 3-二羟基丙酮(dihydroxyacetone, DHA)的累积,阻断DHQ、DHS、莽草酸的分支代谢途径,积累莽草酸产量高达141 g/L,是目前莽草酸微生物合成产量最高的菌株[14]。莽草酸高产工程菌不仅为药物“达菲”提供了合成前体,也为其他莽草酸衍生物提供了原材料,使得微生物合成方法成为获取莽草酸化合物的主要途径之一。王钦宏研究组开发了一种基于转录组辅助的代谢物感应(transcriptome-assisted metabolite-sensing, TAMES)策略来高效挖掘代谢物的感应元件,并通过建立基于感应元件的生物传感器,将细胞内的小分子代谢物转化为可识别的表型(荧光信号等),用于小分子代谢物的高通量筛选[15]。研究人员通过TAMES策略,对选择性条件下的DHS生产菌和非生产菌株之间的转录组数据进行分析和RT-qRCR评估,成功缩小候选感应元件的范围,高效鉴定出可响应目标代谢物DHS的感应元件CusR;并进一步构建了基于CusR的生物传感器和基于该生物传感器的DHS高通量筛选平台,在数月内将DHS产量提高了90%以上[15]

2.2 顺, 顺-粘康酸

顺, 顺-粘康酸(ciscis-muconic acid, MA)是大宗化学品己二酸合成的重要前体,属于不饱和二元羧酸,具有成对的共轭双键,在260 nm处具有最强紫外吸收,可作紫外防护剂、树脂涂层及医药、化学品潜在原材料。己二酸(俗称肥酸)是重要的化学工业原料和有机合成中间体,在塑料、树脂等领域应用广泛,可用于制作尼龙产品、增塑剂、润滑脂等,少量用于食品、农业领域作为增酸剂、杀虫剂、粘合剂等,也可用于医药和香料的生产。

1993年,Frost研究组在缺乏3-脱氢莽草酸还原酶的大肠杆菌中,过表达了来源于肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)中的3-莽草酸脱水酶(DHS dehydratase, AroZ)、原儿茶酸脱羧酶(protocatechuate decarboxylase, AroY),来源于Acinetobacter calcoaceticus的1, 2-双加氧酶(catechol 1, 2-dioxygenase, CatA),首次实现了MA在大肠杆菌中的异源合成研究。其中,DHS是莽草酸途径中的重要中间体,在脱水酶AroZ的催化下,生成原儿茶酸,后者经脱羧酶AroY催化生成邻苯二酚,再经CatA的催化,生成MA,摇瓶发酵产量约2.4 g/L[16]。随后,该研究组对MA前体合成途径进行了优化,利用分批补料发酵的方法,获得36.8 g/L的MA生产菌株[17]。为了进一步提升MA产量,Yan研究组设计并构建了多种新型MA生物合成途径,如以色氨酸合成途径中邻氨基苯甲酸为起始化合物,经邻氨基苯甲酸-1, 2-双加氧酶(anthranilate 1, 2-dioxygenase, ADO)催化生成邻苯二酚,后者在邻苯二酚双加氧酶(catechol dioxygenase, CDO)催化下生成MA,摇瓶发酵产量约389.9 mg/L [18]。其中,CDO活性远高于ADO活性,促使邻苯二酚快速转化生成MA,减少邻苯二酚对细胞的毒性作用。此外,MA合成途径可起始于分支酸(chorismate),经分支酸异构酶(isochorismate synthase, ICS)催化生成异分支酸(isochorismate),在异分支酸丙酮酸裂解酶(isochorismate pyruvate lyase, IPL)催化下异分支酸转化生成水杨酸(salicylic acid),再经单加氧酶(salicylate monooxygenase, SMO)催化,水杨酸转化生成邻苯二酚(catechol),过表达CDO条件下,MA产量提高至1.5 g/L [19]。在大肠杆菌中,邻苯二酚可通过氧化脱羧反应生成,也可通过非氧化脱羧反应生成。Yan研究组利用K.penumoniae来源的非氧化脱羧酶(2, 3-dihydroxybenzoic acid decarboxylase, BDC),将肠菌素前体2, 3-二羟基苯甲酸(2, 3-dihydroxybenzoic acid, 2, 3-DHB)转化生成邻苯二酚,CDO催化邻苯二酚生成MA,产量约488 mg/L[20]。在此基础上,Nielsen研究组综合了上述报道的4条MA生物合成途径以及苯酚依赖的新型MA合成途径,优选出3-脱氢莽草酸依赖途径、对羟基苯甲酸依赖途径进行共表达,使得MA产量提高至3.1 g/L,转化率达到15% [21]

除了大肠杆菌之外,酿酒酵母、绿色假单胞杆菌宿主也常用于生物合成MA,如Boles课题组以酿酒酵母为宿主,异源表达AroZ/AsbF、AroY、CDO/CatA,首次在酿酒酵母中合成1.56 mg/L MA[22]。同年,Alper研究组过表达Podospora anserina来源的AroZ、Enterobacter cloacae来源的AroY、Candida albicnas来源的CatA、去反馈抑制的Aro4fbr、敲除Aro3,使得MA在酵母中合成产量提高至141 mg/L [23]。此后,Alper研究组利用生物传感器依赖的筛选方式,进行两轮定向进化,筛选出MA高产菌株,产量从154 mg/L提高至500 mg/L [23]。AroY是MA合成途径中限速酶,共表达细菌来源的AroY和真菌来源的同工酶GDC1,有效地提高原儿茶酸(protochatechuic acid, PCA)转化生成邻苯二酚的效率。Tripp课题组通过敲除葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate gehydrogenase, Zwf1)、过表达转酮酶(transketolase, TKl1)增强E4P供给、优化3-DHS合成途径代谢流和提高PCA转化效率等方法,获得高产MA的酿酒酵母菌株,以葡萄糖为碳源,MA产量达到1 244 mg/L [24]。此外,张雪洪课题组以Pseudomonas chlororaphis HT66为研究对象,甘油为碳源,将MA合成途径中AroZ、AroY、CatA等基因整合至竞争途径——吩嗪合成途径基因簇中,产量高达3 376 mg/L,其中,过表达基因均由吩嗪合成基因簇中强启动子转录表达[25]。利用代谢工程改造和合成生物学技术手段,设计、构建并优化生产MA的非天然生物合成途径(图 2),获取高效转化简单碳源生成MA的微生物工程菌株,为以MA为原料的高附加值化合物工业化生产奠定了良好的基础。

MA:顺, 顺-粘康酸;PCA:原儿茶酸;2, 3-trans-CHD:(S, S)-2, 3-二羟基苯甲酸;2, 3-DHB:2, 3-二羟基苯甲酸;AroZ:3-脱氢莽草酸脱水酶;AroY:原儿茶酸脱羧酶;CatA:邻苯二酚-1, 2-双加氧酶;TrpEG:邻氨基苯甲酸合成酶;ADO:邻氨基苯甲酸-1, 2-双加氧酶;ICS:分支酸异构酶;EntB:异分支酸酶;EntA:2, 3-二羟基苯甲酸脱氢酶;BDC:2, 3-二羟基苯甲酸脱羧酶;ubiC:分支酸丙酮酸裂解酶;Kpd:异分支酸丙酮酸裂解酶;Ph:酚羟化酶图 2 顺, 顺-粘康酸生物合成

除了大肠杆菌之外,酿酒酵母、绿色假单胞杆菌宿主也常用于生物合成MA,如Boles课题组以酿酒酵母为宿主,异源表达AroZ/AsbF、AroY、CDO/CatA,首次在酿酒酵母中合成1.56 mg/L MA[22]。同年,Alper研究组过表达Podospora anserina来源的AroZ、Enterobacter cloacae来源的AroY、Candida albicnas来源的CatA、去反馈抑制的Aro4fbr、敲除Aro3,使得MA在酵母中合成产量提高至141 mg/L [23]。此后,Alper研究组利用生物传感器依赖的筛选方式,进行两轮定向进化,筛选出MA高产菌株,产量从154 mg/L提高至500 mg/L [23]。AroY是MA合成途径中限速酶,共表达细菌来源的AroY和真菌来源的同工酶GDC1,有效地提高原儿茶酸(protochatechuic acid, PCA)转化生成邻苯二酚的效率。Tripp课题组通过敲除葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate gehydrogenase, Zwf1)、过表达转酮酶(transketolase, TKl1)增强E4P供给、优化3-DHS合成途径代谢流和提高PCA转化效率等方法,获得高产MA的酿酒酵母菌株,以葡萄糖为碳源,MA产量达到1 244 mg/L [24]。此外,张雪洪课题组以Pseudomonas chlororaphis HT66为研究对象,甘油为碳源,将MA合成途径中AroZ、AroY、CatA等基因整合至竞争途径——吩嗪合成途径基因簇中,产量高达3 376 mg/L,其中,过表达基因均由吩嗪合成基因簇中强启动子转录表达[25]。利用代谢工程改造和合成生物学技术手段,设计、构建并优化生产MA的非天然生物合成途径(图 2),获取高效转化简单碳源生成MA的微生物工程菌株,为以MA为原料的高附加值化合物工业化生产奠定了良好的基础。

2.3 熊果苷

熊果苷(arbutin),又称熊果素,属于对苯二酚糖苷类化合物,源于熊果、小麦、梨等植物[26],可通过抑制酪氨酸酶活性,阻断黑色素的合成,从而减少皮肤色素沉淀,达到美白皮肤的效果[27],成为多个国家美白化妆品中的主要原料。此外,熊果苷还具有抗氧化、抗菌、抗炎等生物活性[28-29]。熊果苷分为α-熊果苷和β-熊果苷,其中,α-熊果苷对酪氨酶的抑制强度比β-熊果苷高10倍,且对人体正常细胞无抑制作用,具有更安全、高效的特性。目前,熊果苷获取方式主要包括植物提取、化学合成、酶合成法[30-31]。植物提取熊果苷过程繁琐、提取率低。化学合成催化效率低且选择性差,酶法合成熊果苷逐渐受到关注。据报道,以α-淀粉酶、蔗糖磷酸化酶、葡聚糖蔗糖酶等为催化剂,可将糖基供体转移至对苯二酚的羟基上,合成熊果苷[32-34]

熊果苷天然生物合成途径机制尚未完全阐明,研究人员尝试通过人工设计非天然生物合成途径,实现熊果苷的微生物异源合成。熊果苷的异源合成研究主要面临三个难点:(1)熊果苷前体对苯二酚的微生物合成;(2)高活性糖基转移酶;(3)低成本糖基供体。Van Berkel研究组发现Candida parapsilosis CBS604在4-羟基苯甲酸(4-hydroxybenezoic acid, PHBA)存在的条件下,可诱导黄素腺嘌呤二核苷酸依赖的4-羟基苯甲酸-1-羟化酶(4-hydroxybenzoate 1-hydroxylase, MNX1)表达,催化PHBA羟化、脱羧生成对苯二酚[35],该研究成功地解决了对苯二酚微生物异源合成问题。鉴于E. coli内源合成UDP-葡萄糖,Arend等[36]E. coli中过表达Rauvolfia serpentina来源的UDP-葡萄糖依赖的糖基转移酶(arbutin synthase, AS),催化对苯二酚生成熊果苷。基于此,Yan研究组通过在E. coli中共表达MNX1、AS,首次实现了熊果苷在E. coli的从头合成,产量约55 mg/L [37] (图 3)。在此基础上,过表达了PpsAtktAAroGfbrAroLubiC等多个基因,增强PHBA合成途径代谢流,熊果苷合成产量提高了60倍,约3.29 g/L。葡萄糖不仅作为菌株生长的碳源,也是UDP-葡萄糖合成的重要前体,优化葡萄糖浓度,进一步提高了熊果苷合成产量,约4.19 g/L [37]

ubiC:分支酸丙酮酸裂解酶;MNXI:4-羟基苯甲酸-1-羟化酶;AS:熊果苷合成酶图 3 熊果苷生物合成途径
3 芳香族氨基酸的生物合成

芳香族氨基酸包括L-酪氨酸(L-Tyr)、L-苯丙氨酸(L-Phe)和L-色氨酸(L-Trp),存在于植物、真菌、细菌等生命体中,广泛应用于食品、医药、农业等多个领域。其中,L-Tyr可作为营养增强剂,白癜风患者食用可增强黑色素的合成能力,也可作为抗帕金森药物、酚酸类化合物的原材料。L-Trp常被称为第二必需氨基酸,是动物饲料的重要成分,也是紫色杆菌素、脱氧紫色杆菌素等抗肿瘤药物的合成前体,市场需求量逐年增加[38]。L-Phe是甜味剂阿巴斯甜的重要组成部分,供减肥和糖尿患者使用[39]

芳香氨基酸合成须经糖酵解途径、磷酸戊糖途径、莽草酸途径生成DAHP,后经六步反应生成分支酸,在PheA催化生成苯丙酮酸,苯丙酮酸经氨基酸转氨酶催化得到L-Phe,TyrA催化预苯酸转化生成4-羟基苯丙酮酸,4-羟基苯丙酮酸经过转氨酶催化得到L-Tyr。色氨酸合成途径相对比较复杂,起始于分支酸,在TrpEG、TrpD、TrpF、TrpC、TrpA和TrpB催化作用下生成L-Trp (图 4)。利用代谢工程策略,对细胞内代谢相关酶、物质运输、调节机制等进行改造从而达到提高目标化合物产量的目的。

TyrA:分支酸变位酶/预苯酸脱氢酶;PheA:分支酸变位酶/预苯酸脱氢酶;TyrB:芳香氨基酸转氨酶;TrpEG:氨基苯甲酸合成酶;TrpD:氨基苯甲酸磷酸核糖转移酶;TrpF:磷酸核糖-氨基苯甲酸同分异构酶;TrpC:3-甘油磷酸吲哚合成酶;TrpA/TrpB:色氨酸合成酶;N-PRA:N-(5′-磷酸核糖)-氨基苯甲酸;CRP:5-磷酸烯醇式1-( O-羧基苯氨基)-1-脱氧核酮糖;IGP:3-甘油磷酸吲哚图 4 芳香氨基酸生物合成途径

在芳香族氨基酸高产菌株构建中,常用的代谢工程策略主要包括改造葡萄糖转运系统、提高PEP积累量、解除反馈抑制、过表达限速酶、阻断竞争途径等。PTS系统是葡萄糖进入胞内并生成葡萄糖磷酸的重要转运蛋白复合体,其磷酸供体由PEP去磷酸化获得[38]。PEP是芳香族氨基酸合成途径的重要中间体[40],而PTS系统转运葡萄糖过程消耗PEP,不利于芳香氨基酸的合成。以半乳糖透过酶(galactose permease, GalP)介导的葡萄糖转运系统替代PTS转运系统,可减少PEP的损耗。过表达赤藓糖-4-磷酸合成酶(erythrose 4-phosphate, TktA)、丙酮酸激酶(pyruvate kinase, PykA/PykF)以及提高PEP、E4P积累量,有利于DAHP的合成[41]。在大肠杆菌中,DAHP合成酶由3个基因编码,包括aroGaroFaroH,在整个酶活中所占的比例分别是80%、20%和1%,它们分别受到L-Phe、L-Tyr和L-Trp的反馈抑制[6]。在色氨酸合成途径中,邻氨基苯甲酸合成酶(TrpE)受L-Trp产量抑制,解除L-Trp的反馈抑制作用有利于L-Trp的微生物合成。此外,由TrpR和TyrR这2种阻遏蛋白介导的反馈阻遏作用在大肠杆菌中非常严谨,在芳香族氨酸生物合成时,敲除TrpR、TyrR后,受其负调控的酶活力有所提升,有益于提高微生物合成芳香氨基酸的产量。在敲除竞争途径关键酶、高表达限速酶的条件下,可增强芳香氨基酸合成途径代谢流,成为L-Tyr、L-Phe、L-Trp微生物高产常用策略。根据上述代谢工程改造策略,微生物合成芳香族氨基酸研究取得了一定进展,如表 1所示。

表 1 微生物生产芳香族氨基酸

E. coli合成L-Tyr研究中,Stephanopoulos研究组过表达了PpsATktAAroGfbrTyrA,同时敲除了TyrR负调控基因,获得L-Tyr优化菌株。以葡萄糖为碳源,分批补料发酵生产L-Tyr,产量达到9.7 g/L,转化率约10% [42]。在酪氨酸酶存在的条件下,E. coli宿主可将L-Tyr转化成L-多巴醌,结合E. coli内源酶,L-多巴醌可转化生成黑色素。以黑色素作为筛选高产L-Tyr菌株的标记,Stephano- poulos研究组获得一株良好的L-Tyr生产菌株;在此基础上,敲除TyrR调控因子、PheAygdT,过表达TyrAfbrAroGfbr,获得L-Tyr生产菌株,摇瓶发酵产量达到594 mg/L[43]。优化PheA/TyrA可提高芳香氨基酸的合成产量,Gosset研究组以E. coli来源的分支酸变位酶活性结构域(PheACM)、Zymomonas mobilis来源的去反馈抑制环己二烯脱氢酶(TyrCfbr)替代E.coli来源的双功能酶——分支酸变位酶/预苯酸脱氢酶(CM-TyrAP),并通过高密度发酵的方式生产L-Tyr,产量提高至3 g/L[44]。Keasling研究组利用靶向蛋白质组学、代谢流分析的策略,解决了L-Tyr生物合成中的两个主要瓶颈:3-脱氢莽草酸(DHS)及3-脱氢奎尼酸(DHQ)的积累;脱氢奎尼酸合成酶活性低,导致莽草酸产量低。研究人员以双功能的奎尼酸/莽草酸脱氢酶(AroE)替代YigB,可缓解DHS、DHQ的积累,并且优化脱氢奎尼酸合成酶(AroB)基因的前15个密码子,解决主要瓶颈问题。同时,以莽草酸激酶(AroL)取代同工酶AroK,蛋白表达质粒拷贝数优化,以葡萄糖为碳源,摇瓶发酵,获得2 g/L的L-Tyr生产菌株,转化率达到80% [45]

L-Phe合成途径中DAHP合成酶(AroG)、分支酸变位酶/预苯酸脱氢酶(PheA)均受到终产物L-Phe的反馈抑制作用。去除反馈抑制可有效提高L-Phe合成产量,基于此目的,抗反馈关键酶的筛选及改造得到了广泛且深入的研究。1990年,Backman等[53]E. coli中过表达去反馈抑制的AroFfbr、pheAfbr,发酵36 h后,L-Phe产量达到50 g/L,转化率约25%。然而,其中的突变位点和突变方式尚未报道。陈坚研究组通过NTG诱导法获得去反馈抑制pheAfbr突变子,过表达pheAfbr和AroF的重组菌株E. coli WSHZ06在以葡萄糖为碳源,分批补料发酵58 h的条件下,合成L-Phe,产量为35.38 g/L,转化率约26% [54];进一步优化发酵条件,产量提升至55 g/L。此后,研究人员通过失活PTS葡萄糖转运系统,过表达galPglk基因的方法减少PEP消耗;改造TyrR阻遏蛋白的HTH结构域,以降低对L-Phe合成途径关键酶的抑制作用;同时,利用强启动子表达莽草酸途径中限速酶AroD,获得重组菌株XIIp21,5-L发酵罐分批补料发酵生产L-Phe产量达到72.9 g/L,是当前已报道的最高产量[51-53]

L-Trp的微生物合成研究非常广泛。起初,Azuma等[55]通过随机诱变获得L-Trp生产菌株突变子,添加L-Trp前体的条件下,E. coli合成产量可达到54.6 g/L。由于L-Trp代谢途径调控机制复杂,传统诱变方法只能对其中1~2个调控点起作用,难以对整个代谢流造成影响,代谢工程改造成为获取L-Trp生产菌株的常用手段。色氨酸阻遏物(TrpR)在色氨酸合成、转运、调控中起到至关重要作用。当胞内L-Trp水平偏高,TrpR二聚体结合2个L-Trp分子,并定位到AroH、AroL、trpEDCBA、mtr、trpR操纵子上游区域,抑制蛋白质的表达,不利于L-Trp的生物合成。失活或敲除TrpR基因可提高L-Trp合成途径代谢流,如陈坚研究组发现敲除trpR的FB-01/pSV03菌株生产L-Trp的产量是W3110/pSV03菌株的3.2倍[56]。PTS系统敲除减少PEP损耗,可促进芳香氨基酸产量积累,但菌株生长缓慢。增强GalP和Glk表达水平,提高菌株摄取葡萄糖摄取能力,缓解了PTS敲除菌株生长问题[57]。在此基础上,张大伟研究组在过表达trpEDCBA、AroGfbr、GalP、Glk,敲除TrpRptsHpykF/pykA及抑制Pta的条件下,获得L-Trp生成菌株KW023。以5-L生物反应器分批补料发酵,积累L-Trp产量至39.7 g/L,转化率约16.7% [46]。此外,降低E. coli产酸能力,有利于菌株高密度发酵。Wang等[48]通过敲除葡糖胺磷酸乙酰转移酶(Pta)、色氨酸转运蛋白(Mtr),过表达芳香氨基酸分泌蛋白(YddG),获得E. coli重组菌株,在30-L生物反应器中,以葡萄糖为碳源,分批补料发酵,L-Trp产量达到49 g/L,转化率约21.87%。

4 芳香族氨基酸衍生物的生物合成

芳香族氨基酸衍生物多具有生物活性,如L-Tyr、L-Phe来源的4-香豆酸(4-coumaric acid)、咖啡酸(caffeic acid)、白藜芦醇(resveratrol)、灯盏花素(breviscapine)、黄芩素(scutellarein)、吗啡(morphine)、可待因(codeine),色氨酸来源的5-羟色胺(5-hydroxytryptophan, 5-HT)、长春花碱(vinblastine)、喜树碱(camptothecin)等生物碱类化合物。这些高价值芳香族氨基酸衍生物在食品、医药、化工等领域应用非常广泛。近年来,在微生物中重建生物合成途径,发酵生产高价值化合物研究受到越来越多的关注。以下将对木质素单体、白藜芦醇、覆盆子酮以及灯盏花素、黄芩素等黄酮类化合物以及5-羟色胺、苄基异喹啉类生物碱进行综述,以了解芳香族氨基酸衍生物的生物合成研究进展,为建立高产芳香族化合物细胞工厂奠定基础。

4.1 木质素单体

木质素是一种由香豆醇、松柏醇、芥子醇等木质素单体聚合而成的可再生芳香族聚合物,广泛存在于维管植物细胞壁中,具有增强植物体机械强度、促进细胞运输能力、抵御病菌微生物侵害等功能[58]。在工业生产中,可用于制备生物燃料和高价值化学品,作为石化资源的替代原料展现出良好的应用前景[59]。因木质素单体多样,聚合而成的木质素种类多样,包括紫丁香基木质素、愈创木基木质素、对-羟基苯基木质素及其他木质素混合体。

目前,木质素单体的生物合成途径已经被基本阐明,起始于芳香族氨基酸苯丙氨酸、酪氨酸,在PAL或TAL催化下,转化生成肉桂酸、4-香豆酸,再经过一系列羟基化、甲基化、还原反应,生成4-香豆醇(4-coumaryl alcohol)、咖啡醇(caffeoyl alcohol)、松柏醇(coniferyl alcohol)、芥子醇(sinapic acid)等木质素单体(图 5)。木质素单体及其衍生物是多种高价值化合物合成中间体,如白藜芦醇[60]、香豆酰脂肪酸酯类化合物[61]、4-香豆醇- γ-O-甲酯[62]等,具有抗氧化、抗炎、抗癌等多种生理活性,在食品、医药领域倍受关注。

PAL:L-苯丙氨酸裂解酶;TAL:L-酪氨酸裂解酶;4CL:4-香豆酰-CoA连接酶;C4H:肉桂酸羟化酶;COMT:O-甲基转移酶;CCR:肉桂酰-CoA还原酶;CAD:醇脱氢酶图 5 木质素单体生物合成途径

近年来,基于莽草酸途径,实现了微生物合成木质素单体4-香豆醇、咖啡醇以及松柏醇。为实现4-香豆醇的E. coli异源合成,Jansen研究组共表达Rhodobacter sphaeroides来源的TAL、Petroselinum crispum (X13324)来源的4CL、Zea mays来源的肉桂酰CoA还原酶(cinnamoyl coenzyme A reductase, CCR)和肉桂醇脱氢酶(cinnamyl-alcohol dehydrogenase, CAD),最终以L-Tyr为前体,异源合成4-香豆醇,产量约22 mg/L [63]。为进一步提高4-香豆醇合成产量,Summeren-Wesenhagen等[64]在转录组水平上对4-香豆醇合成途径关键基因组合优化,产量提高至52 mg/L。筛选不同来源的高催化活性蛋白酶和对已有蛋白质进行改造是提高目标产物合成途径代谢流的常用策略[9,65]。袁其朋研究组通过筛选不同来源的TAL、4CL、CCR和CAD,以催化活性高、可溶性好的同工酶,包括 Rhodobacter glutinis来源的TAL、Arabidopsis thaliana来源的At4CL、Leucaena leucocephala来源的CCR以及Saccharomyces cerevisiae来源的醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase, ScADH6),重新构建了一条4-香豆醇合成途径,以葡萄糖为碳源,合成4-香豆醇的产量提升至501.8 mg/L [66]。此外,他们通过共表达HpaBC、4CL、CCR和CAD,转化4-香豆酸生成咖啡醇,产量约30 mg/L,伴随有副产物左旋多巴(L-dopa)的生成[66]。鉴于E. coli宿主菌对4-香豆醇的转运能力比L-Tyr、L-Dopa强,利用菌株共培养方式发酵,提高4-香豆醇转化成咖啡醇的能力,减少副产物L-Dopa的干扰,最终咖啡醇的合成产量达到了401 mg/L[66]。氧甲基转移酶(o-methyltransferase, COMT)除了催化咖啡醇生成松柏醇之外,也可以催化咖啡酸生成阿魏酸。在共表达COMT、4CL、CCR和CAD的条件下,咖啡酸也可转化生成松柏醇,最终E. coli异源合成松柏醇的产量达到了125 mg/L[66]。人工设计、构建非天然木质素单体合成途径,不仅提高了4-香豆醇、咖啡醇、松柏醇的微生物合成产量,也为高价值的天然和非天然芳香醇衍生物的微生物合成研究提供参考。

4.2 白藜芦醇

白藜芦醇(resveratrol)属于芪类化合物,是葡萄、红酒以及其他食品中的一种成分,具有抗氧化、抗炎、抗血小板聚集和癌症预防作用[60]。白藜芦醇生物合成途径起始于酪氨酸,酪氨酸经裂解酶催化生成4-香豆酸,随后4-香豆酸经CoA连接酶催化生成4-香豆酰CoA。当以4-香豆酰CoA为起始单元,引入3分子的丙二酰CoA,在III型聚酮合酶(polyketide synthase, PKS)催化下底物缩合生成白藜芦醇(图 6)。

TyrA:分支酸变位酶/预苯酸脱氢酶;PheA:分支酸变位酶/预苯酸脱氢酶;TyrB:芳香氨基酸转氨酶;TAL:L-酪氨酸裂解酶;4CL:4-香豆酰-CoA连接酶;STS:芪合成酶;BAS:苯亚甲基丙酮合成酶;BAR:苯亚甲基丙酮还原酶图 6 白藜芦醇和覆盆子酮的生物合成途径

为实现白藜芦醇微生物异源合成,Koffas研究组筛选了多种不同来源的白藜芦醇合成酶(stibene synthase, STS),从蛋白表达宿主、启动子强度、酶动力学参数等多方面进行探究,最终优选出葡萄来源的STS和拟南芥来源的At4CL [67]。在菌株BW27784中共表达STS和At4CL,添加15 mmol/L 4-香豆酸和0.05 mmol/L浅蓝菌素的条件下,发酵生产白藜芦醇,产量达到2.3 g/L [67]。鉴于4-香豆酸、浅蓝菌素价格高,陈坚研究组通过多模块代谢工程改造策略,以酪氨酸为前体,在菌株中引入酪氨酸转氨酶(TAL)、4-香豆酰CoA连接酶,丙二酰CoA同化途径、STS,以葡萄糖为唯一碳源的条件下,异源合成白藜芦醇。通过质粒拷贝数、启动子强弱的调控,解决白藜芦醇生物合成瓶颈问题,产量约35 mg/L[68]。该研究以一步发酵法取代了常用的两步发酵法,简化了发酵的流程、节省了菌株培养成本,为工业化生产白藜芦醇提供了良好的基础。此后,朱宝泉研究组将TAL、4CL以及STS整合到基因组tyrR和trpED位点,tyrR替换以去除L-Tyr反馈抑制作用、trpED替换以敲除L-色氨酸合成途径,实现了无质粒合成白藜芦醇的大肠杆菌重组菌株,以葡萄糖为碳源,白藜芦醇产量约5 mg/L,该研究为建立遗传稳定的工业化白藜芦醇生产菌株提供了参考[69]。除了优化L-Tyr合成途径之外,董明盛研究组通过引入Rhizobium trifolii来源的丙二酰CoA同化途径,下调脂肪酸合成途径中FadD、FadH、FadB、FadF、FadI等关键酶表达的策略,增强白藜芦醇合成前体丙二酰CoA供应,并通过筛选不同来源的TAL、人工改造TAL等策略,提高TAL蛋白表达水平及催化活性,实现白藜芦醇高产,约304.5 mg/L[70]。除了大肠杆菌之外,酿酒酵母也是合成白藜芦醇的常用宿主,Nielsen研究组通过引入异源白藜芦醇合成途径,包括Herpetosiphon aurantiacus来源的TAL、拟南芥来源的At4CL、Vitis vinifera来源的STS、去反馈抑制、乙酰CoA羧化酶(acetyl-CoA carboxylase, ACC1)、多拷贝整合、分批补料发酵等优化策略,首次实现了酿酒酵母异源合成白藜芦醇,产量约235.6 mg/L[71]

4.3 覆盆子酮

覆盆子酮(raspberry ketone)是草莓、黑莓、葡萄、大黄等水果和蔬菜中的主要香气成分,是国际公认的安全香料之一,广泛应用于日用香料、食品香料、日化香精和烟用香精中,其化学结构、生物合成途径与白藜芦醇类似。据报道,植物来源的覆盆子酮合成起始于4-香豆酰CoA,在III型聚酮合酶-覆盆子酮合成酶(benzalacetone synthase, BAS)催化下,4-香豆酰CoA与1分子丙二酰CoA缩合生成覆盆子酮前体苯亚甲基丙酮(benzalacetone),后者在苯亚甲基丙酮还原酶(benzalacetone reductase, BAR)催化下生成覆盆子酮[72](图 6)。除了植物以外,真菌Nidula niveo-tomentosa也能生产覆盆子酮,以1分子苯甲酰CoA与2分子丙二酰CoA缩合生成苯亚甲基丙酮,并进一步还原生成覆盆子酮及其醇衍生物4-(4-羟基苯基)-丁烷2-醇[73-74]

目前,天然覆盆子酮主要从植物中提取,但提取率低、成本高,无法大量生产。基于植物源覆盆子酮生物合成途径的解析,Beekwilder等[74]E. coli为宿主,过表达4CL、BAS,在添加3 mmol/L 4-香豆酸前体条件下,成功实现覆盆子酮的异源合成,产量约5 mg/L;若以S. cerevisiae为宿主,覆盆子酮合成产量非常低。为提高S. cerevisiae合成覆盆子酮产量,Lee等[75]筛选了拟南芥来源的At4CL1、香芹来源的Pc4CL2、大黄来源的BAS,在S. cerevisiae中组合表达,催化4-香豆酸与丙二酰CoA缩合生成覆盆子酮,产量约0.43 mg/L;此后,他们又利用蛋白融合表达的策略优化菌株生产能力,使得覆盆子酮产量提高至2.81 mg/L;在好氧发酵条件下,覆盆子酮的合成产量进一步提高至7.54 mg/L;最终,通过共表达AtC4H、RtPAL、Pc4Cl2-r-RpBAS,首次实现覆盆子酮在酿酒酵母中的从头合成,产量约3.49 mg/L[75]

4.4 黄酮类化合物

黄酮类化合物是指以C6-C3-C6碳骨架为基本组成的一类化合物总称,属于植物次级代谢产物,具有多种生理功能和药用价值。目前为止,已知黄酮类化合物种类超过1万种,根据结构不同可分为二氢黄酮、黄酮、异黄酮、黄酮醇、黄烷醇和花色素六大类,多以糖苷的形式存在。植物中,黄酮类化合物的生物合成起始于苯丙氨酸,经苯丙氨酸裂解酶、羟化酶、CoA连接酶作用生成4-香豆酰CoA,经查尔酮合成酶(chalcone synthase, CHS)催化下,4-香豆酰CoA与3分子的丙二酰CoA缩合生成查尔酮(chalcone),在查尔酮异构酶(chalcone isomerase, CHI)作用下,形成二氢黄酮类化合物。二氢黄酮是其他黄酮类化合物的重要前体物质,经不同酶催化作用,生成黄酮、黄酮醇、异黄酮、黄烷醇、花色素等。近年来,黄酮类化合物的微生物合成研究取得了突破,如灯盏花素(breviscapine)、黄芩素(scutellarein)、圣草酚(eriodictyol)等(图 7)。

PAL:L-苯丙氨酸裂解酶;TAL:L-酪氨酸裂解酶;4CL:4-香豆酰-CoA连接酶;C4H:肉桂酸羟化酶;CHS:查尔酮合成酶;CHI:查尔酮异构酶;FNS:黄酮合成酶;F3′H:黄酮-3′-羟化酶;CPR:细胞色素P450还原酶;F6H:黄酮-6-羟化酶;F7GAT:黄酮-7-O-葡萄糖基转移酶;UDPGDH:UDP-葡萄糖脱氢酶图 7 黄酮类化合物生物合成途径

灯盏花素来源于植物灯盏花,又名野黄芩苷,临床用于治疗脑血栓形成及脑栓死等所致完全性及不完全性瘫痪,同时对冠心病、高黏滞血症、白斑癌变等疾病也有一定疗效。江会锋研究组在灯盏花基因组测序数据库中,筛选得到灯盏花素合成途径中两个关键酶,包括黄酮-6-羟化酶(flavone-6-hydroxylase, F6H)、黄酮-7-O-葡萄糖基转移酶(flavonoid-7-O-glucuronosyltransferase, F7GAT),并以酿酒酵母为宿主,成功实现灯盏花素的异源合成,并通过代谢工程改造、发酵优化,灯盏花素的酵母发酵产量提高至108 mg/L[76]

黄芩是一种传统中草药,可用于治疗发热、支气管等疾病,已有数千年的使用历史。黄芩素是植物黄芩中的主要活性成分,具有抗病毒、去除氧自由基、抗肿瘤等生理活性。一直以来,黄芩素的生物合成途径并未完全阐明。2018年,Zhao等[77]首次揭示了黄芩素在植物黄芩中的生物合成途径,包括两条合成途径,一条是经典的黄酮合成途径,以柚皮素为中间体合成黄芩素,另一条是以松鼠素为中间体,合成白杨素,最终生成黄芩素。在此基础上,王勇研究组通过异源表达Petroselinum crispum来源的4CL、黄酮合成酶(flavone synthase, FNS)、Rhodotorulatoruloides来源的PAL、Petunia hybrida来源的CHS、Medicago sativa来源的CHI、Scutellaria baicalensis Georgi来源的黄酮羟化酶(flavone C-6 hydroxylase, F6H)以及Arabidopsis thaliana来源的细胞色素P450还原酶(cytochrome P450 reductase, AtCPR),首次实现黄芩素的异源合成,产量约8.5 mg/L,伴随有野黄芩素的合成,产量约47.1 g/L[78]。进一步优化丙二酰CoA合成途径,黄芩素产量提高至23.6 mg/L,野黄芩素产量提高至106.5 mg/L[78]。黄芩素的异源合成研究为其他高价值黄酮类化合物的微生物异源合成提供参考。

圣草酚,又名北美圣草素,来源于柠檬和花生,具有抗氧化、抗炎、镇痛等生理活性。为实现圣草酚的微生物合成,研究人员通过在大肠杆菌表达Rhodotorula glutinis来源的TAL、Petroselinum crispum来源的4CL、Petunia hybrida来源的CHS、Mirza Sativa来源的CHI,以酪氨酸为前体,成功实现柚皮素的合成。在此基础上,过表达黄酮3′-羟化酶(flavonoid 3′-hydroxylase, F3′H)、CPR,催化柚皮素转化生成圣草酚;同时,通过敲除乙酸激酶(acetate kinase, ackA),过表达乙酰CoA合成酶(acetyl-CoA synthase, ACS)、乙酰CoA羧化酶(Malonyl-CoA:acetyl- CoA carboxylase, ACC),增强丙二酰CoA合成途径代谢流,最终实现以酪氨酸为前体,生物合成圣草酚,产量达到107 mg/L[79]

4.5 5-羟色胺

L-Trp是含有吲哚环结构的芳香氨基酸,经莽草酸途径分支途径中邻氨基苯甲酸衍生而来,是众多吲哚生物碱的合成前体,如5羟色胺(serotonin, 5-HT)。5-HT由色氨酸经过羟基化、脱羧化反应生成。其中,色氨酸羟化酶(tryptophan hydroxylase, TPH)是一种四氢化蝶呤(tetrahydroiopterin, BH4)依赖的羟化酶,也是5-HT生物合成的关键调控因子,以BH4、O2为底物,Fe2+为辅因子,TPH催化色氨酸生成5-羟基色氨酸(5-hydroxytryptophan, 5-HTP),后者在5-羟基色氨酸脱羧酶(aromatic amino acid decarboxylase, TDC)的作用下生成5-HT (图 8)。在欧洲,5-HTP是用于多种疾病治疗的处方药,在美国也作为非处方药的食品营养剂在售卖。5-HT衍生物,如舒马普坦、那拉曲坦、利扎曲普坦等在医药领域应用广泛[80-81]。5-HT广泛分布于植物中,在哺乳动物的组织中也有分布,是中枢神经系统中的神经递质,目前主要从植物Griffonia simplicifolia中提取,受季节、区域影响的植物原材料供应有限,分离成本高,限制其在临床治疗中的广泛应用。

BH4:四氢生物蝶呤;TPH:色氨酸羟化酶;TDC:5-羟色氨酸脱羧酶图 8 5-HT生物合成途径

TPH是5-HT合成途径中的限速酶,在人体中,人们发现了两个5-色氨酸羟化酶,序列相似度达到72%,TPH1位于11号染色体,THP2位于12号染色体[82]。目前,TPH1与TPH2在大肠杆菌、毕赤酵母菌中已经成功表达并纯化。由于TPH稳定性非常差,容易形成包涵体,利用大肠杆菌宿主表达很难大量纯化,无法达到大规模生产的要求[83]。如Knight等在E. coli表达Oryctolagus cuniculus来源的色氨酸-5-羟化酶(tryptophan-5-hydroxylase, T5H),并共表达BH4合成途径及再生系统以提供蝶呤辅酶,添加外源L-Trp前体条件下,获得产物5-HTP,约198 mg/L,产率并不理想[84]。据报道,一些细菌,如PseudomonasChromobacterium来源的芳香氨基酸羟化酶家族AAAHs如能够羟化L-Trp,但催化效率非常低[85-86]。在此基础上,研究人员通过筛选、重构、蛋白质改造等方法获取高活性苯丙氨酸-4-羟化酶(P4H),高效转化L-Trp生成5-HTP,同时构建MH4辅酶再生系统,最终5-HTP合成产量达到1.2 g/L [87]。此后,Park等[88]利用Catharanthus roseus来源的TDC,催化5-HTP脱羧生成5-HT,但转化率低(约35 mg/L)。为实现以葡萄糖为碳源,从头合成5-HT,Zeng研究组通过在大肠杆菌中过表达Cupriavidus taiwanensis来源的CtAAAH,MH4再生系统构建异源生产菌株,以葡萄糖为碳源,异源合成5-HTP,产量约962 mg/L[89]。随后,利用过表达Catharanthus roseus来源的TDC的菌株转化5-HTP生成5-HT,产量约154 mg/L,该研究首次实现了以葡萄糖为碳源从头合成5-HT,为建立低成本、高产率的5-HTP、5-HT及其衍生物的工程菌株奠定基础[89]。Wang等[90]在大肠杆菌中重构BH4循环再生途径,过表达TPH1,以L-Trp为前体,摇瓶发酵生产5-HT,产量达到1.2 g/L;同时,利用多功能模块构建、优化策略,实现5-HT的从头合成,在摇瓶发酵条件下,产量达到1.3 g/L,扩大培养后,产量提高至5.1 g/L,是目前文献报道的最高产量[90]

4.6 苄基异喹啉类生物碱

自然界中,20%的植物可以合成生物碱类次级代谢物,约有12 000种生物碱被报道,其中,已有许多化合物被开发成现代药物。目前,约2 500种生物碱属于苄基异喹啉类生物碱(benzylisoquinoline alkaloid, BIAs),主要来源于Berberidaceae、Menisper- maceae、Papaveracea等植物,具有镇痛、镇咳、抗炎、抗痉挛等生物活性[81]

BIAs生物合成途径起始于多巴胺(dopamine)和4-羟基苯乙醛(4-hydroxyphenylaldehyde),经过类曼尼西反应,立体特异性地生成了三羟基生物碱(S)-去甲乌药碱(norcoclaurine)。这种三羟基取代结构式经O-甲基化生成(S)-乌药碱(coclaurine),再经N-甲基化、羟基化生成重要中间体牛心果碱(reticuline),后者是合成其他生物碱的关键体,如延胡索乙素(tetrahydropalmatine)、小檗碱(berberine)、白屈菜红碱(chelerythrine)、血根碱(sangulnarine)、吗啡(morphine)、可待因(codeine)等(图 9)。酿酒酵母作为一种真核模式菌,因细胞环境有利于表达细胞色素P450酶、异戊烯基转移酶、FAD-依赖型氧化还原酶等优势,常被用来异源合成复杂的植物次级代谢物。

NCS:去甲乌药碱合成酶;6OMT:6-O-甲基转移酶;CNMT:乌药碱-N-甲基转移酶;NMCH:N-甲氧基乌药碱-3′-羟化酶;4′OMT:3′-羟基-N-甲基乌药碱-4′-O-甲基转移酶;BBE:小檗碱桥酶图 9 苄基异喹啉类生物碱生物合成途径

近年来,在酵母中构建BIAs的生物合成途径研究广泛,如Fossati等[91]将罂栗中血根碱生物合成通路上的多个基因整合到酵母基因组中,实现了多基因在酵母中的共表达,生成高药用价值的血根碱(sangulnarine)。Smolke研究组将BIAs中间体(S)-牛心果碱的生物合成途径重组到酵母中进行共表达,成功实现了(S)-牛心果碱的异源合成,筛选了多种不同来源的细胞色素P450还原酶基因,并在酵母中重组表达,提高了BIAs在酵母中的产量[92]。2015年,该研究组对吗啡的生物合成途径进行了阐释,并且首次实现药物吗啡在酿酒酵母中的全合成,为其他BIAs的全合成奠定了良好的基础[93]。随后,他们进一步优化酪氨酸合成途径,提高前体酪氨酸、4-羟基苯乙胺的产量,并异源表达酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase, TyrH)、6-O-甲基转移酶(norcoclaurine 6-O-methyltransferase, 6OMT)、乌药碱-N-甲基转移酶(coclaurine N-methyltransferase, CNMT)、N-甲氧基乌药碱-3′-羟化酶(N-methylco-claurine 3′-hydroxylase, NMCH)、细胞色素P450 NADPH依赖型还原酶(cytochrome P450 NADPH-reductase, CPR)以及3′-羟基-N-甲基乌药碱-4′-氧甲基转移酶(3′-hydroxy-N-methylcoclaurine 4′-O-methyltransferase, 4′OMT),首次实现牛心果碱在酵母中的从头合成[94]。此外,2018年,Smolke研究组在酿酒酵母中从头合成诺司卡品,其中,诺司卡品合成途径包含了30多个酶,分别来源于植物、细菌、哺乳动物、酵母,有7个植物内质网膜蛋白,产量从120~230 ng/L提高至2.2 mg/L;同时,通过添加酪氨酸衍生物至诺司卡品生产菌株中,证明了微生物合成卤代诺司卡品的能力[95]。目前为止,多种BIAs在酿酒酵母中已经实现了全合成,然而,BIAs合成途径复杂,涉及动物、植物、微生物等不同来源的酶,合成途径中多基因共表达水平对BIAs的合成影响较大。BIAs异源全合成产量普遍较低,进一步优化BIAs合成途径,提高合成产量在未来应用中具有重要价值和意义。

5 结论与展望

随着合成生物学的发展,利用微生物代谢工程生产芳香族化合物已成为重要方式之一。芳香族化合物主要来源于莽草酸途径,在过去的二十年里,莽草酸、分支酸、芳香氨基酸及其衍生物的微生物异源合成研究均取得了很好的成果。然而,部分芳香族化合物微生物生产得率仍然较低。为了进一步提高发酵法生产芳香化合物的竞争力,提高芳香化合物微生物合成产量可以从以下几方面进行考虑:(1)解析各种芳香族化合物,尤其复杂芳香族化合物的生物合成途径;(2)研究莽草酸合成通路的代谢调控,提高葡萄糖利用率,增强磷酸戊糖途径供应赤藓糖-4-磷酸的能力,减少糖酵解途径中PEP的消耗,解除反馈抑制,对分支途径进行阻断或者下调;(3)通过筛选、酶改造等方式,获得催化活性或可溶性提高的合成途径限速酶;(4)深入研究关键前体及辅因子包括丙二酰CoA、UDP-葡萄糖、NADH/NADPH等的调控机制,增加供给。随着一些新的生物技术的出现和应用,相信微生物合成芳香化合物研究会取得更大的进展。

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