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浙大吴坚平实验室建立基于CRISPR-Cas的恶臭假单胞菌基因组编辑和转录抑制工具

   日期:2018-03-29     来源:生物催化剂设计与改造服务    浏览:764    评论:0    
核心提示:近日,浙江大学吴坚平实验室在恶臭假单胞菌KT2440中建立了基于CRISPR-Cas系统的基因编辑工具,可快速实现KT2440中的基因编辑和转录抑制。
  

     浙大吴坚平实验室建立基于CRISPR-Cas的恶臭假单胞菌基因组编辑和转录抑制工具
     恶臭假单胞菌是一种非致病革兰氏阴性菌,由于具备丰富的代谢多样性和对多种恶劣条件的耐受性,近年来越来越受到人们的关注,被作为一种理想的底盘细胞用于生物降解、生物催化以及化学品的合成。近日,浙江大学吴坚平实验室在恶臭假单胞菌KT2440中建立了基于CRISPR-Cas系统的基因编辑工具,可快速实现KT2440中的基因编辑和转录抑制。 该文章《Genome editing andtranscriptional repression in Pseudomonas putida KT2440 via the type IICRISPR system》近日发表于Microbial Cell Factories杂志上。本研究质粒获取方式请见文末。
     本文中,研究者分别利用Cas9和Cpf1两种热门CRISPR–Cas系统,在恶臭假单胞菌模式菌KT2440中成功建立了快速基因编辑方法。结果显示,利用本文开发的CRISPR–Cas9方法可5天内实现KT2440中的基因敲除、插入或替换,编辑效率超过70%。基于该CRISPR–Cas9系统,研究人员进一步开发了无痕的两步法单碱基突变方法,可克服对PAM序列的依赖,实现KT2440中的单碱基突变,效率高达100%。此外,研究人员利用核酸酶活力缺陷的Cas9突变体(dCas9)实现了KT2440中基因的转录抑制,可对KT2440中表达的egfp基因表达水平降低至28.5%,29.4%和 72.1%。
     在2017年10月,西班牙研究人员率先在Biotechnology Journal杂志上发表了在恶臭假单胞菌KT2440中建立CRISPR-Cas9基因组编辑方法的文章(下称“BTJ文章”),与BTJ文章的三质粒系统相比,本研究应用了可快速进行质粒消除的双质粒系统,使得对KT2440的快速(5天)、连续编辑成为现实。虽然与BTJ文章在单基因敲除、单碱基突变效率基本一致,本研究在建立单碱基编辑方法时克服了对PAM序列的依赖;此外,本研究进一步完善了CRISPR-Cas系统在KT2440中的应用,实现了基因插入、替换以及转录抑制;同时CRISPR-Cpf1系统的成功建立也更加拓宽了CRISPR-Cas工具箱在KT2440的应用。
 
     本文所构建适用于恶臭假单胞菌KT2440的CRISPR-Cas双质粒系统已在Addgene(http://www.addgene.org/)和金斯瑞(Genscript,https://www.genscript.com/)公布。Addgene编号:pCAS-RK2T(106400),pSEVA-gRic6T(106401)和pCAS-ZE3(106402)。金斯瑞编号:pCAS-RK2T(MC_0000261),pSEVA-gRic6T(MC_0000262),pCAS-ZE3(MC_0000263)。
 
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