Box-Behnken设计-响应面法优化地龙活性组分的冻干工艺

目前，对从地龙中提取得到地龙蛋白的工艺研究较多^{[8, 9]}，但对已获得的活性蛋白后续处理工艺的研究较少，因此本实验旨在能够最大程度确保其活性组分有效性的基础上，通过工艺处理后，较稳定地保存已提取蛋白。本实验采用单因素试验结合Box-Behnken响应面法^[10]，以冻干率为指标，优化地龙活性组分的冻干工艺，采用HPLC法，测定优化后工艺样品的指纹图谱，并比较其与地龙药材指纹图谱相似度，确定最佳冻干工艺，为地龙同体制剂的研制提供实验依据。

UV-2600型紫外可见分光光度计，日本岛津公司；电子分析天平，梅特勒-托利多（上海）仪器有限公司；LYO-0.5（CIP）真空冷冻干燥机，上海东富龙科技股份有限公司；SPX-250BZ型生化培养箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；TD5A-WS台式低速离心机，长沙湘鹰离心机有限公司；安捷伦1260液相色谱仪系统，美国安捷伦公司；相似度软件为“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”，中国药典委员会。17种氨基酸混合对照品（门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸）、衍生试剂A（异硫氰酸苯酯-乙腈溶液）和衍生试剂B（三乙胺-乙腈溶液）均来自月旭公司氨基酸分析包；尿激酶、凝血酶（牛血）、纤维蛋白原（牛血）均购自中国食品药品检定研究院，批号分别为140604-201224、140605-201125、140607- 201338；琼脂糖，BR级，批号121129，上海如吉生物科技发展有限公司；地龙对照药材，批号120987-201107，购自中国食品药品检定研究院；实验用水为娃哈哈纯净水；其他试剂为分析纯。地龙药材购自亳州中药材市场，产地广东佛山，批号20131106，经湖北省药学会中药鉴定分会陈科力教授鉴定为钜蚓科动物参环毛蚓Pheretima aspergillum (E. Perrier) 的干燥体。

称取地龙粗粉100 g，加水500 mL，浸泡60 min，超声处理（250 W，50 Hz）60 min，12 000 r/min离心10 min，得上清液。分别将A、B 2种衍生试剂用乙腈稀释至原来浓度的1/5，精密量取上清液1 mL，置于试管中，加入稀释后的A溶液0.5 mL和稀释后的B溶液0.5 mL，涡旋混合1 min，在50 ℃水浴中加热45 min，取出，加入正己烷溶液1 mL，振摇，涡旋混合1 min，静置30 min，吸取下层澄清液体，用孔径为0.45 μm有机滤膜滤过，即得到衍生化后的样品溶液。

冻干率是物料冻干后脱水质量占物料水分总量的比例，本实验采用费休氏水分测定法测定样品中的含水量从而计算出冻干率。

冻干率＝1－含水量

（1）对照品溶液的制备：取Welch公司17种氨基酸混合对照品溶液（原浓度）用水稀释至原来浓度的1/10作为对照品溶液。

（2）色谱条件：色谱柱为Ultimate Amino Acid AAA氨基酸分析柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，月旭材料科技有限公司）；体积流量1.0 mL/min；柱温40 ℃；进样量5 μL；检测波长254 nm。流动相A为0.1 mol/L醋酸钠溶液（pH 6.5）-乙睛（93∶7）；流动相B为水-乙腈（20∶80），二元梯度洗脱，洗脱程序：0～11 min，100%～93% A；11～13.9 min，93%～88% A；13.9～14 min，88%～85% A；14～29 min，85%～66% A；29～32 min，66%～30% A；32～35 min，30%～0% A；35～45 min，0% A；45～60 min，100% A。

（3）精密度试验：取“2.1”项下衍生化后供试品溶液，按照上述色谱条件连续进样6次。将6次测定图谱转化为AIA格式后依次导入相似度软件，输出17个共有峰峰面积的RSD为0.12%～3.43%，保留时间的RSD为0.04%～0.31%，表明仪器精密度良好。

（4）稳定性试验：取“2.1”项下制备的同1份衍生化后供试品溶液，在上述色谱条件下分别在0、2、4、6、8、12、24、48、72 h进样，进行测定。测定图谱转化为AIA格式后依次导入相似度软件，输出17个共有峰峰面积的RSD为0.17%～2.81%，保留时间的RSD为0.03%～0.13%，表明样品在72 h内稳定。

（5）重复性试验：取“2.1”项下平行制备的6份衍生化后供试品溶液，按照上述色谱条件进行测定。测定图谱转化为AIA格式后依次导入相似度软件，输出17个共有峰峰面积的RSD为0.41%～3.58%，保留时间的RSD为0.03%～0.15%，表明方法的重复性良好，证明分析方法和提取工艺的稳定性和可靠性。

（6）共有图谱的建立：取“2.1”项下的衍生化后供试品溶液，按照上述色谱条件连续进样10次，取对照品溶液，按色谱条件项下条件进行测定并标示，如图 1所示，峰1～17为地龙氨基酸组分提取物中含有的17种氨基酸成分，分别为门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸。其中峰10（胱氨酸）在HPLC图谱中分离良好，质量分数较高且稳定，所以选择其为参照峰，共标示了17个共有峰。

1-门冬氨酸 2-谷氨酸 3-丝氨酸 4-甘氨酸 5-组氨酸 6-精氨酸 7-苏氨酸 8-丙氨酸 9-脯氨酸 10-胱氨酸 11-缬氨酸 12-蛋氨酸 13-异亮氨酸 14-亮氨酸 15-酪氨酸 16-苯丙氨酸 17-赖氨酸 图 1 地龙氨基酸组分提取物参照图谱 Fig.1 Reference fingerprint of extract components of amino acid in lumbricus 1-aspartic acid 2-glutamic acid 3-serine 4-glycine 5-histidine 6-arginine 7-threonine 8-alanine 9-proline 10-cystine acid 11-valine 12-methionine 13-isoleucine 14-leucine 15-tyrosine 16-phenylalanine 17-lysine

溶液装入10 mL烧杯中，置于冻干机前箱，插入共晶点探头及温度探头，启动共晶点测定仪，设定冻干机预冻温度为−50 ℃，预冻3 h，测定共晶点。按照冻干理论^[7]，为保证物料完全冻结，产品预冻温度一般应选择在共晶点温度以下5～15 ℃为宜，经测定该制品溶液的共晶点为−16.5 ℃，共融点为−17.9 ℃，据此推测预冷冻温度应低于−26.5 ℃，为确保产品在预冻时完全冻结，试验选择−26.5 ℃为预冻温度。

精密吸取地龙药液，在−26.5 ℃下预冻，在−25 ℃进行升华干燥16 h，40 ℃进行解析干燥6 h，绝对压力维持在15 Pa左右^[14]，预冻时间分别设置为2、3、4、5 h，以冻干产品外观性状和冻干率为指标考察不同预冻时间对产品质量的影响，结果见表 1。预冻时间仅2 h时，冻干产品外观收缩，呈黄色团块，随着预冻时间的延长，产品的性状良好，质地疏松，在预冻时间为4～5 h时，冻干品的外观及冻干率质量最好，因此确定预冻时间为4 h。

表 1(Table 1)

表 1 预冻时间对产品质量的影响 Table 1 Effects of pre freezing time on product quality 预冻时间/h 性状 冻干率/% 2 收缩，黄色团块 50.00 3 略有鼓泡，淡黄色块状物， 质地疏松 93.46 4 淡黄色块状物，质地疏松 94.31 5 淡黄色块状物，质地疏松 94.33

表 1 预冻时间对产品质量的影响 Table 1Effects of pre freezing time on product quality

升华干燥又称第1阶段干燥，是指冻结产品中的冰晶升华成水蒸气逸出而使产品脱水干燥。当全部冰晶除去时，第1阶段干燥完成，此时除去全部水分的90%左右。升华时所需热量由搁板供给，产品在干燥时期温度必须低于其共融点的温度，同时考虑到产能，因此在−26.5 ℃的温度下预冻4 h，绝对压力维持在15 Pa左右，40 ℃进行解析干燥6 h的条件下，选择升华干燥温度−18、−20、−22、−24 ℃ 4个水平进行单因素试验，结果见表 2。升华阶段搁板温度在低于共融点下，温度越高，产品的性状良好，质地疏松，颜色均匀，产品冻干率提高；温度越低，在同等升华干燥时间内，产品外观颜色深，冻干率明显降低，可能是产品干燥不充分，需要延长升华干燥时间，但是从能耗角度，已经不具备可行性，因此确定升华干燥温度−18、−20、−22 ℃作为Box-Behnken设计实验的3个水平。

表 2(Table 2)

表 2 升华干燥温度对产品质量的影响 Table 2 Effects of sublimation drying temperature on product quality 搁板温度/℃ 性状 冻干率/% −18 质地疏松，淡黄色块状，颜色均匀 92.60 −20 质地疏松，淡黄色块状，颜色较均匀 96.01 −22 质地疏松，淡黄色块状，颜色均匀 94.18 −24 质地疏松，淡黄色块状，中间颜色深 88.75

表 2 升华干燥温度对产品质量的影响 Table 2Effects of sublimation drying temperature on product quality

在升华干燥阶段，升华时间是很关键的因素，时间太短，搁板温度很快达到预定的温度，使供给物料的热量也增加的过快，导致超过物料的共融点温度使其融化。因此在确定−26.5 ℃的温度下预冻4 h，40 ℃进行解析干燥6 h，暂定升华温度为−20 ℃不变的条件下，选择以下4个时间段位因素进行考察，结果见表 3。进入升华干燥阶段，升华时间过短会导致冰晶融化，冻干率很低，随着升温时间的延长，产品性状良好，时间过长会加长冻干周期且消耗不必要的能量，因此确定升华时间6、7、8 h作为Box-Behnken设计实验的3个水平。

表 3(Table 3)

表 3 升华时间对产品质量的影响 Table 3 Effects of sublimation time on product quality 升华时间/h 性状 冻干率/% 5 收缩，颜色不均匀 33.00 6 质地疏松，淡黄色块状，颜色均匀 94.18 7 质地疏松，淡黄色块状，颜色均匀 96.01 8 质地疏松，淡黄色块状，颜色均匀 95.60

表 3 升华时间对产品质量的影响 Table 3Effects of sublimation time on product quality

为了使产品达到合格的残余含水量，必须对产品进一步干燥，产品的热量主要靠搁板供给，所以在−26.5 ℃的温度下预冻4 h，−20 ℃进行升华干燥7 h不变的条件下，选择20、25、30、35 ℃ 4个温度进行单因素试验，结果见表 4。在解析干燥阶段，随着温度的上升，冻干效果显著，当搁板温度为30 ℃时，冻干产品性状良好，骨架结构完整，海绵状，颜色均匀，冻干效果已经较好，随着搁板温度继续增高，冻干率也不能增加，且增加产能，因此确定解析温度20、25、30 ℃作为Box-Behnken设计实验的3个水平。

表 4(Table 4)

表 4 解析干燥温度对产品质量的影响 Table 4 Effects of analytical drying temperature on product quality 搁板温度/℃ 性状 冻干率/% 20 质地疏松，黄色块状物，中间颜色 稍深 93.08 25 质地疏松，淡黄色块状，颜色均匀 94.25 30 质地疏松，淡黄色块状，颜色均匀 95.51 35 质地疏松，淡黄色块状，颜色均匀 95.48

表 4 解析干燥温度对产品质量的影响 Table 4 Effects of analytical drying temperature on product quality