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武大孙宇辉实验室结合Cas9切割与噬菌体包装克隆50Kb以下基因组DNA更简便

   日期:2019-09-11     来源:合成生物催化剂    浏览:564    评论:0    
核心提示:作者提出了一种体外包装介导的克隆方法:他们设计引入CRISPR/Cas9系统,用于特异性切割和释放感兴趣的天然产物合成途径,同时开发体外包装介导的方法,将途径与线性化通用载体连接并在体外包装到噬菌体颗粒中以感染大肠杆菌。该过程主要涉及常规的DNA处理,但提供了一种快速方便的途径克隆方法,并能在一周内有针对性地克隆目标途径。
  
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直接克隆天然产物合成途径以进行有效的重构和异源表达已经成为微生物天然产物研究和发现的重要策略,尤其是针对在原始菌株中沉默或表达不佳的途径或基因。因此,开发方便有效的克隆方法变得越来越有必要。体内克隆策略是实验室最常用的策略,但相关方法极大依赖原始菌株的遗传操作系统,因为这些都需通过同源重组实现并涉及费时的筛选过程,此外目前最有价值的CRISPR/Cas系统用于微生物基因组编辑的应用仍然相对有限。

 

 

 

在本文中,作者提出了一种体外包装介导的克隆方法:他们设计引入CRISPR/Cas9系统,用于特异性切割和释放感兴趣的天然产物合成途径,同时开发体外包装介导的方法,将途径与线性化通用载体连接并在体外包装到噬菌体颗粒中以感染大肠杆菌。该过程主要涉及常规的DNA处理,但提供了一种快速方便的途径克隆方法,并能在一周内有针对性地克隆目标途径。利用该方案,作者分别克隆了来源于链霉菌NRRL15439的Tü3010(27.4kb)合成途径和来源于伊纽小单孢菌DSM46123的西索米星sisomicin(40.7kb)合成途径,并且进一步引入了stuR以正向调节Tü3010的合成。体外包装介导的靶向克隆方法不仅能够激活沉默途径,而且还有助于与各种基因编辑系统一起重构该途径。

 

因此,这一方法具有快速、方便和通用性,它可广泛用于天然产物合成途径的靶向克隆。

 

相关研究发表于ACS Synthetic Biology:In vitro Packaging Mediated One-Step Targeted Cloning of Natural Product Pathway。

 
 
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