野黄芩苷（Scutellarin）是一种具有抗炎、抗氧化以及改善心脑血管缺血等活性的黄酮类糖苷，目前在临床上被广泛用于心脑血管疾病的治疗，国内每年的市场需求量估计高达100吨。然而，目前野黄芩苷主要来源于短葶飞蓬的植物提取，这种传统方法存在种植成本高、受地理环境限制大以及提取效率低（通常产率为0.8-2.5%）等技术瓶颈，难以满足大规模应用的需求。为了突破这些限制，通过合成生物学开发微生物细胞工厂，为实现野黄芩苷的高效、绿色、可扩展生物合成提供了极具潜力的替代方案。
2026年6月1日，来自华东理工大学的叶邦策教授团队在《Journal of Agricultural and Food Chemistry》杂志上发表了题为“Systematic metabolic Engineering and Fermentation Optimization of Yarrowia lipolytica for High-Yield Production of Scutellarin”的研究论文。该团队通过系统性的代谢工程手段，成功在解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）中实现了野黄芩苷的从头生物合成。研究首先将关键限速酶SbF6H与其还原酶ATR2（Sl1A）进行融合，使催化效率提升了12.57%。随后，通过在黄酮合酶I（FNS I）上添加促溶标签，使得野黄芩苷的效价提高了44.33%。此外，研究人员还引入了木糖诱导系统协同上调FNS I和Sl1A的表达水平，并通过重塑代谢网络强化了前体物质的供应。经过发酵工艺与培养基的优化，最终构建的工程菌株在摇瓶水平下的产量达到1,184.24 mg/L，而在5升生物反应器的补料分批发酵中，其产量更是高达6,370.39 mg/L，这是迄今为止所报道的微生物发酵最高滴度，且副产物比例仅为7.26%。这些结果表明，该研究不仅为野黄芩苷的工业化规模生产奠定了可扩展的平台基础，也为利用微生物合成其他高附加值黄酮类化合物提供了具有普适性的工程化框架。
图1. 系统代谢工程改造解脂耶氏酵母高效合成野黄芩苷
研究人员首先选取了一个前期构建的高产柚皮素解脂耶氏酵母作为底盘菌株（Ylscu2-00），用于重构野黄芩苷的生物合成途径。该底盘菌株在深孔板中发酵72小时后，可积累710.89 mg/L的柚皮素，同时伴有442.19 mg/L的前体对羟基肉桂酸（p-CA）的积累。随后，研究团队引入了FNS I、SbF6H、ATR2、F7GAT和UDPGDH这五个途径酶基因，构建了初始菌株Ylscu2-01，其野黄芩苷产量为232.28 mg/L，但产生了69.24 mg/L的副产物A7OG。鉴于P450酶SbF6H是该途径的关键限速酶，研究人员测试了不同长度和序列的连接肽（linker），将其与截短的还原酶74tATR2进行融合表达。实验结果表明，采用linker1的菌株（Ylscu2-02）表现最佳，其野黄芩苷产量达到261.48 mg/L，较独立表达对照组提升了12.57%。同时，柚皮素积累量下降至44.12 mg/L，证实了融合表达能够缩短蛋白质空间距离并提高电子传递效率，从而有效促进了代谢通量向目标产物的转化。
图2. 在高产柚皮素底盘菌株中重构野黄芩苷生物合成途径
为进一步解除代谢瓶颈，研究人员评估了黄酮合酶I（FNS I）在酵母中的表达状态，蛋白质印迹分析证实其在解脂耶氏酵母中溶解度较差，主要以不溶性的蛋白聚集体形式积累。为了改善其可溶性表达，研究人员选取了来自酿酒酵母的SUMOStar和解脂耶氏酵母内源的yliSUMO两种促溶标签，分别融合至FNS I的N端或C端进行测试。结果显示，N端融合策略能够显著提升产物效价，其中带有内源yliSUMO标签的N端融合菌株（Ylscu2-08）合成效能最高，野黄芩苷滴度达到了377.40 mg/L。相较于Ylscu2-02菌株，采用该最优标签使得野黄芩苷的产量提高了44.33%。机制探究表明，内源蛋白酶可将融合的yliSUMO标签切除释放出游离的FNS I，且该标签可能通过提升蛋白质的翻译效率或稳定性增加了FNS I总蛋白的表达量，增强了对野黄芩苷生物合成的催化能力。
图3. 通过促溶标签融合增强FNS I的表达
为了协同上调关键酶FNS I和还原酶融合蛋白（Sl1A）的表达水平，研究团队在菌株中引入了基于VPRHX转录激活因子和Pxo结合位点的木糖诱导激活系统。研究考察了不同浓度木糖对产物合成的影响，发现在添加4 g/L木糖时系统的诱导效果达到饱和。在此浓度下优化诱导时机，结果表明在发酵12小时进行诱导能够获得最高产量，野黄芩苷滴度达到496.03 mg/L，较组成型表达菌株（Ylscu2-08）提升了31.43%。此外，该共诱导策略有效重构了途径的代谢平衡，将副产物A7OG的滴度控制在58.49 mg/L，其在总产物中的占比从24.90%下降至10.56%。生长曲线分析显示，该诱导系统并未对宿主细胞造成显著的生长代谢负担。
图4. 引入木糖诱导激活系统以增强FNS I和Sl1A的表达
优化下游途径酶表达后，研究人员外源添加前体对羟基肉桂酸（p-CA，500 mg/L或1 g/L），发现野黄芩苷产量分别显著提升至666.91 mg/L和769.28 mg/L，证实了胞内前体供应不足是限制高产的关键因素。为此，研究团队实施了“推-拉-阻”的系统代谢工程策略重塑芳香族氨基酸代谢网络。具体而言，在原有引入AroG*-TyrA*强化莽草酸途径（推）的基础上，通过将关键竞争基因PHA2的启动子截短至50 bp进行敲低，限制碳通量向苯丙氨酸流失（阻）；同时过表达酪氨酸解氨酶基因（TAL），拉动代谢流向p-CA转化（拉）。经过改造，工程菌株Ylscu2-11的野黄芩苷滴度跃升至927.08 mg/L，较对照大幅增长了86.90%，并有效降低了具有细胞毒性的副产物肉桂酸积累至32.22 mg/L。
图5. 增强对羟基肉桂酸（p-CA）的供应
莽草酸途径的代谢通量上限受到磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）和赤藓糖-4-磷酸（E4P）两种前体可用性的严格限制。由于酵母天然中心碳代谢中PEP与E4P的碳通量存在显著的不平衡，研究人员在菌株Ylscu2-11中引入了异源磷酸酮解酶（PHK）途径。该途径包含磷酸酮解酶（PK）和磷酸转乙酰酶（PTA），能够将果糖-6-磷酸转化为E4P和乙酰辅酶A（Acetyl-CoA），后者也是合成目标产物所需的关键前体。引入该途径构建的菌株Ylscu2-12，其野黄芩苷滴度推高至1,106.60 mg/L，相较于Ylscu2-11提升了19.36%。这表明引入异源PHK途径有效突破了内在代谢限制，通过增加胞内E4P和乙酰辅酶A供应，提升了生物合成效率。
图6. 引入异源磷酸酮解酶（PHK）途径重塑中心碳代谢
针对高成本蛋白胨制约规模化发酵的问题，研究团队对发酵培养基进行了降本增效优化。在等摩尔氮含量下，完全的无机或有机氮源替代均会导致合成效能下降。最终研究采用混合策略，以60%的磷酸氢二铵（DHP）替代蛋白胨，并辅以3.0 g/L的廉价玉米浆粉（CSP），既保障了细胞生长，又使产物滴度维持在1,036.36 mg/L。考虑到关键酶FNS I的活性依赖，培养基中进一步补充了5 mM的维生素C，使摇瓶发酵72小时的野黄芩苷最高滴度达到1,184.24 mg/L，较对照提升了14.27%。该优化策略在使产物效价提升的同时，将生产成本降低了约53%。
图7. 摇瓶水平下菌株Ylscu2-12发酵培养基的优化
最后，研究人员将优化后的发酵培养基应用于5升生物反应器中，对最优工程菌株Ylscu2-12进行了初步的发酵放大实验，以评估其工业化生产的潜力。在发酵过程中，当发酵液中的残糖浓度降至2.00 g/L以下时，系统启动含有1.0 g/L维生素C的糖氮混合补料，并将残糖浓度严格控制在1.00至1.50 g/L之间，以防止潜在的产物降解。实验结果显示，细胞在发酵12小时后进入对数生长期，野黄芩苷在12至60小时内以相对稳定的速率持续合成。
图8. 5 L生物反应器中LSTa的两阶段生产工艺
发酵进行至84小时时，野黄芩苷滴度达到最高值6,370.39 mg/L。此时，细胞光密度（OD600）达到171（对应细胞干重为25.0 g/L），糖到产物的转化效率为2.11%。此外，整个发酵过程中前体对羟基肉桂酸（p-CA）和柚皮素的水平始终保持在较低状态，表明前体向目标产物的转化效率极高；而副产物A7OG的滴度为498.80 mg/L，仅占总黄酮产量的7.26%。这些数据充分验证了该工程菌株在放大培养条件下的高产能力，展示了其在工业化应用中的极大前景。
总之，这项工作通过系统代谢工程手段和发酵调控，在解脂耶氏酵母中成功搭建了高效生产野黄芩苷的细胞工厂。基于建立的重构与优化策略，终态工程菌株在5升生物反应器发酵84小时后其最高滴度突破性地达到了6,370.39 mg/L，副产物A7OG比例低至7.26%。这一滴度水平约为当前植物提取得率的10倍，表现出极大的生产优势。该研究成果摆脱了植物提取对特殊环境与资源的依赖，为利用廉价碳源合成同类高附加值天然产物提供了绿色且可规模化的技术借鉴。
