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发酵液中分离多粘菌素E的生产工艺研究

   日期:2020-01-05     来源:绿色科技    浏览:1178    评论:0    
核心提示:主要研究了沉淀法分离提取发酵液中多粘菌素E(Colistin sulfate)的生产工艺。对超滤液热絮凝、吸附脱色、碱性沉淀以及浓缩液二次脱色等工艺参数进行了考察,结果表明:工艺最佳条件:超滤液90~95℃热絮凝5min后,板换快速冷却,复合脱色处理:加碳量0.1%、亚硫酸盐0.5%~1.0%,沉淀条件:pH值为11.0~12.5、15~30℃、静置1h,浓缩液脱色添加0.4%~0.8%活性炭,处理0.5h,最高收率达到90%以上,成品各项指标符合EP生产标准。通过连续稳定性试验对各个参数进行验证,得到了
  
 马文艳 潘忠成 王卫富 翁婧 李蒲民

 

 

 

摘要:主要研究了沉淀法分离提取发酵液中多粘菌素E(Colistin sulfate)的生产工艺。对超滤液热絮凝、吸附脱色、碱性沉淀以及浓缩液二次脱色等工艺参数进行了考察,结果表明:工艺最佳条件:超滤液90~95℃热絮凝5min后,板换快速冷却,复合脱色处理:加碳量0.1%、亚硫酸盐0.5%~1.0%,沉淀条件:pH值为11.0~12.5、15~30℃、静置1h,浓缩液脱色添加0.4%~0.8%活性炭,处理0.5h,最高收率达到90%以上,成品各项指标符合EP生产标准。通过连续稳定性试验对各个参数进行验证,得到了适用于工业化生产的多粘菌素E分离工艺。

关键词:硫酸粘杆菌素;沉淀分离法;碱性多肤;絮凝

中图分类号:TQ923 文献标识码:A 文章编号:1674-9944(2019)22-0186-04

1 引言

多粘菌素E是一种碱性多肽类抗生素,兽用硫酸粘菌素商品为其硫酸盐。目前生产中主要是连续树脂法分离提取[1,3],但此法污水量大,工艺复杂,收率低。文献报道中的对多粘菌素E分离技术较多[2,4,5],但都不能形成可行性的生产工艺。活性炭是一种传统的脱色剂,其生产工艺简单,可操作性强,效率高,是抗生素生产提取工艺常见脱色方法。沉淀法分离抗生素是一种传统方法,具有操作简单,但由于多粘菌素的碱性不稳定性[5,6],收率不稳定,尚无利用此法的生产报道。作者在前期研究在碱性沉淀法[8]上做了大量基礎工作,本文通过对利用传统的活性炭预处理和碱性沉淀法分离多粘菌素E进行研究,优化各项工艺操作参数,并与膜分离[2]等工艺结合,获得了能够替代树脂法的多粘菌素E生产工艺。

2 材料与方法

2.1 材料

多粘菌素E标品(BR)由天津施瑞克公司提供,硫酸及硫酸盐等其他试剂为国产分析纯,活性炭为福建大林森木质活性炭。

2.2 实验方法

(1)多粘菌素E测定高效液相色谱法(HPLC),文献[9]改进方法。

(2)蛋白相对含量测定方法采用紫外分光光度计,设定波长280nm,物料稀释50~100倍测定吸光值。

(3)色素相对含量测定方法采用可见分光光度计,设定波长400nm测定吸光值。

3 结果与分析

3.1 多粘菌素E超滤液预处理

3.1.1 热处理

对超滤液进行热处理(结果见图1),试验过程中,加热温度80℃以上时,蛋白絮凝量逐渐增多,色素量降低,当温度高于90℃左右出现拐点,色素去除率下降,蛋白去除率升高减缓,同时降解率快速升高。

结果表明:温度在90℃左右最佳,可除去较多的杂质,收率保持在95%以上,褐变反应加快。因此,热处理过程应快速升温及降温,尽量缩短温度对效价和褐变反应的影响。

3.1.2 脱色处理

陶瓷清液90~95℃热处理,活性炭和还原剂复合影响效果明显(图2),色素去除率与还原剂量呈正相关,蛋白去除率与之无关,当还原剂量超过1%,对收率产生负影响。结果表明,亚硫酸盐对褐变反应速率抑制及还原性脱色有较好影响,但过量盐加入,可能影响多粘菌素E的电荷状态或构象,稳定性降低导致降解发生。

活性炭对热处理后滤液的脱色效果(图3),活性炭加入量和杂质去除率、效价损失率呈正相关。结果表明:较少的活性炭对效价也有明显的影响,但其脱色及去蛋白效果又很显著,因此保证收率的前提下0.1%的炭量处理为最佳。

3.2 多粘菌素E碱性沉淀过程

3.2.1 不同条件对多粘菌素E稳定性的影响

前期的试验数据和药典记录一致,碱性条件下,尤其是溶液或湿晶体状态下,硫酸粘杆菌素降解受pH值、温度、时间等因素影响明显。

碱性pH值条件下,多粘菌素E的稳定性较差,沉淀絮凝和降解反应同时发生。pH值和温度对稳定性的影响(见图4,图5),结果表明:pH值低于11.5的时理论降解率反而更高,pH值在11.5~12.0,沉降过程的理论降解率较低。结果说明,pH值和温度都偏低时,多粘菌素E多呈溶解短肤,更易降解;而pH值和温度过高,直接导致碱性降解反应速率加快。

这与试验过程观测到的情况一致,条件前期多粘菌素的形成絮凝速率和降解率呈负相关,而调碱后期,尤其是较高温度,絮凝沉淀快速形成,降解率反而降低。多粘菌素E呈游离短肽时,更易降解,降解量的累计和时间呈正相关(图6)。结果表明:在试验过程,调碱操作时间越短,降解率越低,0.5~1h的生产操作时间可以降理论降解率控制在10%以内。

3.2.2 不同条件对多粘菌素E沉淀收率的影响

pH值和温度对沉降收率的影响(见图7,图8),结果表明:pH值在11.5左右,温度在25℃左右,沉降收率分别达到最高。

沉降时间对收率的影响(见图9),结果表明:沉降时间在1h左右,收率达到最高85%~86%。而在保护剂的作用下(见图10),0.1%~0.2%的还原性保护剂可以和环境中的氧化性基团作用,提高活性短肽的惰性,收率提高到88%~89%。

3.2.3 不同条件对多粘菌素E浓缩液脱色处理效果的影响

超滤液在pH值为4.0时,不同活性炭量的脱色结果(见图11),色素的去除率同活性炭量呈正相关,少量活性炭对色素的吸附效率较高,过量加入活性炭的色素吸附效率明显下降;脱色时间的色素去除率的影响较小,但炭加入过多,脱色时间较长,对效价损失影响明显,脱色时间控制在0.5h左右最适。

采用0.6%活性炭脱色,考察pH值对活性炭的脱色效果影响(见图11)。结果表明:相对较高的pH有利于色素的去除,但效价损失率也较高。结果可见,pH值为4.0左右色素去除率较高,同时效价损失率明显降低。

氧化剂脱色与活性炭的复合脱色作用结果(图12),复合处理比活性炭单独处理色素去除率提高15%左右,氧化剂与有机物活性基团的反应能力较强,极易对效价产生影响,使用量不宜过多。

不同活性炭量对复合脱色效果的影响(见图13),结果表明,活性炭量对复合处理色素去除率影响较小,但对效价损失影响较大。

不同浓度浓缩液对复合处理的脱色影响(见图14),结果表明,浓缩液效价在400~800万单位之间,效价高低和脱色效果呈负相关。这说明高效价浓缩液粘度较大,脱色过程色素与活性炭的表面接触几率降低,同时多粘菌素E被活性炭吸附后,活性炭的吸附能力进一步降低。

3.3 工艺稳定性试验

采用以上试验最佳结果进行多批试验,同时对脱色后浓缩液进行高温喷干形成成品。对试验各步收率进行统计以及成品各项指标结果(见表1,表2)。

连续进行多批工艺稳定性验证,总收率收率和干粉指标都达到预期目标,工艺各阶段质量控制稳定。

4 结论

(1)工艺最佳条件:超滤液90~95℃热絮凝5~10min后,冷却过滤,一次脱色加碳量0.1%、亚硫酸盐0.5%~1.0%,沉淀条件pH值为11.0~12.5、15~25℃、静置1h,浓缩液添加0.4%~0.8%活性炭脱色0.5~1h,最高收率达到90%以上。

(2)少量的亚硫酸盐类保护剂和活性炭的复合处理效果明显,但生产应用还有待进一步生产验证。

(3)脱色后喷干成品各项指标达到EP标准,通过试验连续验证,该工艺流程简单,完全可以达到生产要求。

参考文献:

[1]顾觉奋,寇晓康,杜振宁,等.离子交换与树脂吸附在制药工业上的应用[M].北京:中国医药科技出版社,2008.3

[2]杨亚勇,刘珍奇,蒋顺进.超滤膜在多粘菌素E预处理中的应用[J].中国抗生素杂志,2001(4):244~245.

[3]邢维玲,周希贵,王贺祥,等.离子交换层析法提取黏杆菌素的研究[J].中国兽医杂志,2002(11):44~46.

[4]佟斌,劉桂敏,吴兆亮,等.泡沫分离提取多粘菌素E的工艺研究[J].食品工业科技,2007,28(5):153~155

[5]孟杰,刘桂敏,赵艳丽,等.硫酸多黏菌素E水溶液的表面张力和泡沫性能的研究[J].中国抗生素杂志,2007,32(11):696~672.

[6]常晓菲,王宏,王静.硫酸多粘菌素B提取工艺的研究进展[J].北方药学,2011(10):13~14.

[7]马卫明,佘锐萍,彭芳珍,等.肽类抗生素研究进展[J].中国兽医杂志,2005,6(41):38~41.

[8]丁绪芹,张劲松,王福岭.沉淀法分离硫酸粘杆菌素工艺研究[J].中国兽药杂志,2013,47(6):27~30.

[9]解庆镇,顾吉林.多粘菌素E的高效液相色谱测定[J].中国抗生素杂志,1988(13):36~40.

收稿日期:2019-10-09

基金项目:陕西省科技项目(编号:2018ZKC-173;2019-PT-15);渭南市科技局项目(编号:ZDYF-SFGG-17-ZSG)

作者简介:马文艳(1981-),女,硕士,主要从事应用微生物及生物医药方面的工作。

通讯作者:潘忠成(1974-),男,博士,主要从事应用微生物及生物医药方面的工作。

 
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