利用重组嗜热栖热菌尿苷-胞苷激酶生产尿苷酸

摘要尿苷-胞苷激酶(Uridine/cytidine kinase, UCK)作为生物体核苷酸代谢补偿途径中的重要催化剂，可以催化尿苷和胞苷磷酸化成为尿苷酸(5′-uridine monophosphate, 5′-UMP)和胞苷酸(5′-cytidine monophosphate, 5′-CMP)。利用大肠杆菌EscherichiacoliBL21(DE3)分别成功克隆表达了来源于嗜热栖热菌(ThermusthermophilusHB8)以及枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis168)的尿苷-胞苷激酶。对比分析了不同重组尿苷-胞苷激酶的催化特性发现，来源于嗜热栖热菌的尿苷-胞苷激酶能以鸟苷三磷酸(Guanosine 5′-triphosphate, GTP)或者腺苷三磷酸(Adenosine 5′-triphosphate,ATP)作为磷酸供体催化尿苷生成尿苷酸，而来源于枯草芽孢杆菌的尿苷-胞苷激酶只有以GTP作为磷酸供体时的催化效果较好。在优化的反应条件下，使用来源于嗜热栖热菌的尿苷-胞苷激酶，6 h可催化10 mmol/L的尿苷和10 mmol/L的ATP生成8.74 mmol/L尿苷酸。研究结果表明，以ATP作为磷酸供体的尿苷-胞苷激酶可作为一种新型的催化剂用于尿苷酸的研制与生产。

关键词尿苷酸；尿苷-胞苷激酶；嗜热栖热菌；枯草芽孢杆菌；大肠杆菌

尿苷酸是一种重要的核苷酸产品，可作为食品添加剂、药品以及药物前体应用于不同领域[1]。作为母乳中含量第二大的核苷酸，它是婴幼儿食品中常用的添加剂[2-3]；能参与肝脏解毒物质葡萄糖醛酸苷的合成[4]，也可作为膜磷脂的前体提高脑部胞苷二磷酸胆碱和乙酰胆碱水平[5-6]；以其为前体的碘苷也已广泛应用于临床[7]。

现有的尿苷酸的生产方法主要包括化学合成法和核糖核酸(Ribonucleic Acid,RNA)降解法。化学法是将尿苷溶解于酸性溶液中，将2,3位的羟基保护后再使用有毒的POCl3试剂作为磷酸化试剂合成尿苷酸[8-9]，整个过程收率较高但是生产安全性差，容易造成污染。RNA降解法是使用5′-磷酸二酯酶降解来自于酵母细胞的RNA[10-11]，整个过程相对环保但是产品分离困难，细胞裂解物难于处理。

鉴于现有尿苷酸生产方法的不足，使用生物法制备尿苷酸已经成为目前研究的关注点。WANG等使用产氨短杆菌(CorynebacteriumammoniagenesATCC6872)以乳清酸为底物通过两步法转化生产尿苷酸[12]。YANG等使用重组酿酒酵母(SaccharomycescerevisiaepYX212-URA5/BJX12)全细胞催化乳清酸生产尿苷酸[13]。但上述方法均存在生产周期较长，生产工艺繁琐等问题。QIAN等使用来自大肠杆菌(EscherichiacoliK12)的尿苷-胞苷激酶(Uridine/cytidine kinase, UCK)以尿苷为底物生成尿苷酸。该方法转化周期较短，尿苷酸收率较高，但是催化过程中需要以鸟苷三磷酸(Guanosine 5′-triphosphate, GTP)作为磷酸供体，生产成本较高[14]。

为了获得适用于工业化生产的尿苷酸制备方法，本研究尝试使用大肠杆菌(EscherichiacoliBL21(DE3))分别克隆表达来源于嗜热栖热菌(ThermusthermophilusHB8)[15]以及枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis168)的尿苷-胞苷激酶。对获得的重组尿苷-胞苷激酶的磷酸供体偏好性以及酶学性质进行考察。最后对酶催化反应条件进行优化，提高尿苷酸的产量。

1 材料和方法 1. 1 材料与试剂

1.1.1 菌株和质粒

大肠杆菌E.coliDH5α、大肠杆菌E.coliBL21(DE3)以及质粒pET-His(Ampr)均由本实验室保藏。

1.1.2 培养基

LB(Luria-Bertani)培养基：蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.0～7.2，121 ℃灭菌20 min。

斜面培养基：葡萄糖1 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 5 g/L，牛肉膏10 g/L，琼脂25 g/L，pH 7.0～7.2，121 ℃灭菌20min。

发酵培养基：葡萄糖3 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 5 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO40.5 g/L， VH 1 mg/L，pH 6.5～7.2，葡萄糖115 ℃灭菌15 min，其他成分121 ℃灭菌20 min。

1.1.3 主要试剂

限制性内切酶、T4DNA连接酶、ExTaq DNA聚合酶均购自宝生物工程(大连)有限公司；PCR产物回收及质粒提取试剂盒购自北京博大泰克生物基因有限责任公司；尿苷标品、尿苷酸标品、腺苷三磷酸二钠、鸟苷三磷酸二钠购于美国Sigma公司，其他试剂均为国产分析纯。

1. 2 质粒pETHis- ttCK和pETHis- uck的构建

根据Genbank上T.thermophilusHB8的尿苷-胞苷激酶UCK同系物ttCK序列编码基因序列，在其氨基酸序列第93上设计点突变，使酪氨酸残基突变为组氨酸残基，并用大肠杆菌中常见的密码子优化手段对其进行密码子优化，使其可在大肠杆菌中高效表达，将优化后的序列送至金唯智公司进行合成，得到带有尿苷-胞苷激酶ttCK编码基因的重组质粒pUC57-ttCKY93H。

根据Genbank上B.subtilis168的尿苷-胞苷激酶序列编码基因，设计带有酶切位点BamHⅠ 和EcoRⅠ的引物。以B.subtilis168基因组为模板，利用引物(上游引物：5′CGCGGATCCATGGGTAAGAATCCAGTAGTCATTG3′和下游引物5′CCGGAATTC TGCTATGGTATTACAAAATCGCG3′)及Ex-TaqPCR试剂盒扩增得到尿苷-胞苷激酶编码基因uck。

PCR条件为95 ℃ 5 min 一个循环；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s 30个循环；72 ℃ 10 min 一个循环。反应体系为50 μL，PCR产物经质量分数为1.5%琼脂糖凝胶电泳并切胶回收。

目的产物回收后经BamHⅠ 和EcoRⅠ 酶切、电泳及切胶回收后连接至经相同酶切的表达载体pET-His，并化转至E.coliDH5α感受态细胞中。Super optimal broth with catabolite repression(SOC)中活化后涂布于含氨苄青霉素(100 μg/mL)的LB固体培养基上。37 ℃过夜培养后，挑取单菌落利用引物进行PCR验证，阳性菌株接入含有氨苄青霉素(100 μg/mL)的LB液体培养基中，经37 ℃振荡培养12 h后提取质粒进行酶切验证，获得正确的重组质粒。

1. 3 E. coliBL21- ttCKY93H和E. coliBL21- uck的构建

分别取适宜浓度的质粒pETHis-ttCKY93H和pETHis-uck化转至E.coliBL21(DE3)感受态细胞中，在SOC中活化后涂布于含氨苄青霉素(100 μg/mL)的LB固体培养基上，37 ℃倒置培养12 h。挑取单菌落利用引物进行PCR验证，阳性菌株接入含有氨苄青霉素(100 μg/mL)的LB液体培养基中，经37 ℃振荡培养12 h后保存至甘油管中备用并提取质粒进行酶切验证，获得正确的重组菌株。

1. 4 重组菌培养

将E.coliBL21-ttCKY93H及E.coliBL21-uck以1%(体积分数)接种量接种至5 mL含有氨苄青霉素(100 μg/mL)的LB液体培养基摇管中，37 ℃，200 r/min活化培养12 h，以1%(体积分数)接种量接种至30 mL含有氨苄青霉素(100 μg/mL)的LB液体培养基中，37 ℃，200 r/min培养12 h，再按1%(体积分数)接种量转接至100 mL含有氨苄青霉素(100 μg/mL)的LB液体培养基中，37 ℃，200 r/min培养至OD600=0.6～0.8时，添加终浓度为0.1 mmol/L的诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达目的蛋白，37 ℃条件下，200 r/min摇床诱导10 h。

1. 5 重组菌扩大培养

将E.coliBL21-ttCKY93H接种至斜面培养基，37 ℃活化培养12 h，再将斜面中的菌全部接种至含有斜面培养基的茄形瓶中，在37 ℃传代培养12 h，再将茄形瓶中的菌全部接种至含有3 L发酵培养基的5 L发酵罐中。发酵条件为37 ℃，pH 7.0，溶氧25%～35%(溶氧0%定义为添加了少量硫酸铜的饱和亚硫酸钠溶液中的溶氧，溶氧100%定义为静止空气中的溶氧)，进行重组菌扩大培养。培养4 h后流加6 g/L乳糖，并将温度调低至32 ℃，诱导培养至12 h。

1. 6 粗酶液制备

用离心管收集培养后的菌液，4 ℃，5 000 r/min，离心10 min，弃掉上清液，收集菌体细胞。将细胞沉淀于5 mL PBS缓冲液(10 mmol/L，pH 8.3)中，利用移液枪反复吹吸，使菌体细胞重新悬浮。-80 ℃冻融进行细胞破碎，待溶化后进行高速离心1 h去除不溶性碎屑，取得上清液，此时得到的上清液即为粗酶液，用来作为研究催化反应的酶源。

1. 7 酶催化反应体系建立

(1)反应体系配制：10 mmol/L尿苷，10 mmol/L Mg2+，10 mmol/L GTP或者ATP，不同pH值的PBS缓冲液，适量粗酶液。

(2)酶活力单位定义：在标准酶活测定条件下，1 min催化底物尿苷生成1 μmol/L尿苷酸所需的粗酶液量定义为一个酶活力单位，即1 U。

(3) 5 L罐反应体系： 10 mmol/L尿苷，10 mmol/L Mg2+，pH 7.5的PBS缓冲液，适量粗酶液，反应过程中连续流加1 mmol/L ATP(ATP终浓度10 mmol/L)。

1. 8 底物及产物分析方法

对于底物尿苷和产物尿苷酸，使用高效液相色谱(Agilent 1200)进行分析。检测条件：紫外检测器(270 nm)，色谱柱为Hypersil SAX(5 m，4.6 mm×250 mm)，洗脱液流动相为50 mmol/L NH4H2PO3(pH 4.5)，流速为1 mL/min。

2 结果与讨论 2. 1 重组质粒pETHis- ttCKY93H和pETHis- uck的构建

首先根据Genbank上T.thermophilusHB8的尿苷-胞苷激酶编码基因序列，利用大肠杆菌密码子偏好性对其进行密码子优化，合成得到目的基因ttCK。根据TOMOIKE等人的报道[15]，将T.thermophilusHB8的尿苷-胞苷激酶氨基酸序列中93位的酪氨酸残基突变为组氨酸残基，可以显著增加该酶对于尿苷的亲和力。因此在合成设计时引入Y93H突变位点。其次根据B.subtilis168的尿苷-胞苷激酶编码基因序列，设计引物从B.subtilis168基因组上扩增得到目的基因uck。将上述目的基因分别连接到pET-His表达载体上，利用BamHⅠ 和EcoRⅠ进行双酶切验证，结果如图1所示，经BamHⅠ 和EcoRⅠ双酶切可以获得分子量约为2 900 bp及600 bp的片段，与pET-His和目的基因片段的分子量一致，证明上述目的基因已成功连接到表达载体上。

M-1 kb DNA marker; 1-ttCK片段; 2-pET-His片段;3-重组质粒单酶切(BamH I);4-重组质粒双酶切(BamH I/EcoRI)

图1 单双酶切验证pETHis-ttCKY93H(a)和pETHis-uck(b)

Fig.1 Identification of recombinant plasmids of pETHis-ttCKY93H(a) and pETHis-uck digestion by restricted endonuclease (b)

2. 2 不同来源的重组尿苷-胞苷激酶的表达与鉴定

将重组菌株E.coliBL21-ttCKY93H及E.coliBL21-uck分别接种于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中进行培养，使用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达目的蛋白后，离心收集菌体，超声破壁后得到粗酶液。对破壁之后的样品进行SDS-PAGE蛋白电泳分析，结果如图2所示。重组菌株E.coliBL21-ttCKY93H(泳道3)和E.coliBL21-uck(泳道6)超声破壁后上清液中均在23 ku处出现明显的蛋白条带，与目的蛋白的分子量一致，说明两种不同来源的重组尿苷-胞苷激酶均实现了可溶性表达。由图2还可以看出，2株重组菌株超声破壁后沉淀中也出现目的蛋白条带(泳道2和5)，说明有一些重组酶以包涵体的形式表达。

M-蛋白marker; 1-3代表E.coli BL21-ttCKY93H;4-5代表E.coli BL21-uck;3,6代表菌体超声破壁后上清液;2,5代表菌体超声破壁后沉淀

图2 重组大肠杆菌目的蛋白SDS-PAGE图谱

Fig.2 SDS-PAGE analysis of recombinant proteins in E.coli BL21

2. 3 不同来源的重组尿苷- 胞苷激酶催化特性研究

尿苷-胞苷激酶催化的尿苷向尿苷酸转化过程需要NTP作为磷酸供体。然而，研究表明很多尿苷-胞苷激酶在胞外催化实验时均需要以GTP作为磷酸供体，例如来自于大肠杆菌、保加利亚乳杆菌的尿苷-胞苷激酶[14]。因此，在本实验中分别选择了GTP以及ATP作为磷酸供体，考察不同来源的重组尿苷-胞苷激酶的催化能力，结果如图3所示。来源于T.thermophilusHB8的尿苷-胞苷激酶能以GTP或者ATP作为磷酸供体催化尿苷生成尿苷酸，以GTP为磷酸供体时的尿苷酸最高得率为93.6%，以ATP为磷酸供体时的尿苷酸最高得率为87.8%。相比之下，来源于B.subtilis168的尿苷-胞苷激酶只有以GTP作为磷酸供体时的催化效果较好，尿苷酸最高得率达到91.5%。与GTP相比，ATP是更为廉价的磷酸供体，而且其可以通过多聚磷酸化酶、乙酸激酶等催化的反应进行循环再生[16]。因此，以ATP作为磷酸供体的尿苷-胞苷激酶的发现对于降低酶法合成尿苷酸的生产成本，实现工业规模应用具有重要的意义。

a-来源于嗜热栖热菌的尿苷-胞苷激酶；b-来源于枯草芽孢杆菌的尿苷-胞苷激酶

图3 磷酸供体对于不同重组尿苷-胞苷激酶的催化效果影响

Fig.3 Effect of phosphate donor on the catalyzation of different recombinant uridine/cytidine kinase

2. 4 来源于嗜热栖热菌的重组尿苷- 胞苷激酶的催化反应条件优化

将来源于嗜热栖热菌的重组尿苷-胞苷激酶粗酶液加入到含有10 mmol/L尿苷，10 mmol/L ATP的不同pH值的PBS缓冲液中，对反应温度以及反应pH值进行系统优化，反应时间为6 h。由图4可知，在一定范围内，适当地提高温度和pH值有利于重组尿苷-胞苷激酶活力的提升，而过高的温度以及碱性条件则容易导致酶活力的降低。当温度为37 ℃，pH 7.5时，重组尿苷-胞苷激酶的活性达到最高值。

a-温度优化；b-pH优化

图4 来源于嗜热栖热菌的重组尿苷-胞苷激酶的催化反应条件优化

Fig.4 Optimization of the catalytic reaction conditions of recombinant uridine/cytidine kinase derived from T.thermophilus HB8

在优化的催化反应条件下，进一步考察不同底物浓度对来源于嗜热栖热菌的重组尿苷-胞苷激酶的催化效果影响，结果如表1所示。由于使用的是粗酶液，因此一部分的尿苷会在尿苷磷酸化酶的作用下转化为尿嘧啶，使得尿苷酸的产量降低。过量的底物尿苷存在不利于尿苷酸的合成，当使用2.5 U粗酶液时，6 h内最多可以催化10 mmol/L的尿苷和10 mmol/L的ATP生成8.74 mmol/L尿苷酸。如果ATP不足量，则尿苷的产量会随之下降。

2. 5 利用来源于嗜热栖热菌的重组尿苷- 胞苷激酶催化尿苷生产尿苷酸

使用2.4中优化的反应条件，在5 L的发酵罐中进行重组菌的培养以及酶催化反应放大实验，结果如图5所示。重组菌首先利用葡萄糖进行生长，当葡萄糖消耗完全之后(4 h)，连续流加低浓度乳糖低温诱导产酶直至菌体生物量不再发生变化，此时重组尿苷-胞苷激酶的总酶活可以达到最大值。

表1不同底物浓度对来源于嗜热栖热菌的重组尿苷-胞苷激酶的催化效果

Table1Effectofdifferentsubstrateconcentrationsonthecatalyzationofrecombinanturidine/cytidinekinasederivedfromT.thermophilusHB8

a-重组大肠杆菌在5 L罐中的扩大培养；b-5 L罐中的酶催化反应

图5 利用来源于嗜热栖热菌的重组尿苷-胞苷激酶催化尿苷生产尿苷酸

Fig.5 Production of UMP from uridine by recombinant uridine/cytidine kinase derived from T.thermophilus HB8

收集重组菌提取尿苷-胞苷激酶进行酶催化反应放大实验。在反应初始0 h和2 h分别一次性加入1 mmol/L的ATP，观察尿苷酸的生成情况。结果表明，当加入的ATP消耗完全时，尿苷酸的合成随之停止。在反应的3～11 h内持续流加1 mmol/L的ATP，尿苷酸也随之持续产生，12 h时产量达到最大值8.13 g/L。上述结果表明，连续流加低浓度ATP并不会影响重组尿苷-胞苷激酶的催化效果，后续可以使用聚磷酸激酶催化的ATP再生反应，以少量的ADP作为底物用于尿苷酸的合成，从而进一步降低生产成本，增加工业应用可行性。

3 结论

尿苷酸作为一种重要的食品添加剂和药物前体，已经广泛应用于食品和医药领域。然而，现有的尿苷酸生产方法如化学合成法和核酸水解法存在工艺复杂、酸碱废水排放量较大等问题。开发高效、环保的尿苷酸生产制备工艺迫在眉睫。本研究以常用的大肠杆菌表达系统分别过表达来自于嗜热栖热菌以及枯草芽孢杆菌的尿苷-胞苷激酶基因，并对重组酶的催化特征进行了分析比较，得到了能够以ATP作为磷酸供体的尿苷-胞苷激酶，并对其催化反应条件进行了优化。在37 ℃，pH 7.5的反应条件下，使用来源于嗜热栖热菌的尿苷-胞苷激酶，6 h可催化10 mmol/L的尿苷和10 mmol/L的ATP生成8.74 mmol/L尿苷酸。为了进一步提升酶促反应的经济性，今后可以利用大肠杆菌自身的聚磷酸激酶PPK，以多聚磷酸和少量的ADP为底物，实现ATP的循环再生。将聚磷酸激酶PPK与尿苷-胞苷激酶ttCK进行串联表达，通过全细胞的催化方式制备尿苷酸，最终实现尿苷酸的工业化生物合成。

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Production of uridine monophosphate by recombinanturidine/ cytidine kinase from Thermus thermophilus

FAN Xiao-guang1, JIA Zi-fan1, LI Guo-liang1, HAN Hong-jun2,GAO Li-dong2, ZHANG Shun-tang2, LI Yan-jun1, CHEN Ning1*

1 (College of Biotechnology,Tianjin University of Science & Technology,Tianjin 300457, China) 2 (Post-Doctoral Research Center, Lotus Health Group Company, Xiangcheng 466200, China)

ABSTRACTUridine/cytidine kinase (UCK) is an important catalyst in the nucleotides replenishment pathway. It is responsible for converting uridine and cytidine to 5′-uridine monophosphate (UMP) and 5′-cytidine monophosphate (CMP), respectively. The UCK-producing gene fromThermusthermophilusHB8 andBacillussubtilis168 were successfully cloned and expressed inEscherichiacoliBL21 and DE3, respectively. In addition, the catalytic properties of different recombinant UCK genes were compared. Guanosine 5′-triphosphate (GTP) and adenosine 5′-triphosphate (ATP) was the main phosphate donor of UCK fromThermusthermophilusHB8, while GTP was the main phosphate donor of UCK fromBacillussubtilis168. Under the optimized conditions, 8.74 mmol/L UMP was obtained from 10 mmol/L uridine and 10 mmol/L ATP in 6 h by the UCK fromThermusthermophilusHB8. The results showed that the ATP-dependent UCK can be used in the research and production of UMP as a new catalyst.

Key words5′-uridine monophosphate(5′-UMP); uridine/cytidine kinases(UCK);ThermusthermophilusHB8;Bacillussubtilis168;EscherichiacoliBL21(DE3)

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.015644

引用格式：范晓光,贾子樊,李国梁,等.利用重组嗜热栖热菌尿苷-胞苷激酶生产尿苷酸[J].食品与发酵工业,2018,44(1):7-12.

FAN Xiao-guang, JIA Zi-fan, LI Guo-liang,et al.Production of uridine monophosphate by recombinant uridine/cytidine kinase fromThermusthermophilus[J].Food and Fermentation Industries,2018,44(1):7-12.

第一作者：博士，讲师(陈宁教授为通讯作者，E-mail：ningch@tust.edu.cn)。

基金项目：天津市教委科研计划项目(2017KJ006)；中国博士后科学基金(2016M601269)

收稿日期：2017-09-04，改回日期：2017-09-29