推广 热搜: 万古霉素  谷氨酸发酵  酵母  发酵  发酵罐  维生素  蛋白酶  胰岛素  柠檬酸  阿维菌素 

乳酸链球菌素的发酵

   日期:2011-01-12     来源:发酵工业网    作者:发酵网    浏览:1506    评论:0    
  

A: 概 论

乳酸链球菌素的乳酸链球菌对噬菌体的攻击的异常敏感性是工业规模生产乳酸链球菌素所碰到的主要问题之一。另一个普遍的问题是培养物被野生酵母的感染在生产的任何阶都可能有灾难性的影响。另外, 1955年HAULEY指出, 如果乳酸链球菌素制备物打算用于抗梭菌, 在大多数情况下, 必须特别注意以避免这些微生物对发酵基质的污染, 因为在这些条件下可能形成抗乳酸链球菌素菌株, 并带到产品中。如果牛奶是基质中的组成成分, 这将是非常真实的危险。由于这些原因, 特殊的努力被用于破坏牛奶中梭菌的存在, 以保证没有噬菌体的污染。因此, 必使用无菌基质, 整个生产和干燥过程必须在无菌工厂中进行。

B: 接种

乳酸链球菌素大规模生产接种制备方面的信息是有限的, 1957年Cheseman和Berridge从冻干培养物开始转接到10ml肉汤培养基中, 30℃培养24hr, 然后转到100ml肉汤培养基中, 再培养24hr。这时, 检查培养物的纯度, 再转到含500-1000IU/ml的100ml肉汤培养物中, 30℃继续培养24hr, 然后, 这种培养物被接种到7×100ml肉汤培养基中, 再培养8hr, 通过显微镜检查培养物是纯净的后, 全部7升被用于150升批量发酵肉汤培养基中的接种。

1971年, Bailty和Hurst在发酵前从培养3天的斜面上开始接种, 培养物在含有肉浸出物。酵母浸出物和矿物盐, 并调PH到6.8的富含葡萄糖的培养基中生长, 通过每日接种到较大体积中, 他获得几个1升培养物分别用于20升发酵培养基中接种。

C: 培养基

1951年(b)Hurst注意到, 在一种非缓冲基质中, 一种产乳酸链球菌素的乳酸链球菌能产大约80IU/ml, 24hr后基质的PH值从最初的7.0降到4.6。较低的PH是由乳酸的积累所引起的, 抑制了微生物的生长, 而已合成的乳酸链球菌素分布于基质和细胞中, 周期性地调整PH回复到中性, 可获得较高的细胞生物量和二倍以上的乳酸链球菌素。而乳酸链球菌素几乎全部与细胞相联。然而, Hisrsh注意到当葡萄糖浓度为1%时, 培养12小时后成为限制因素。通过增加葡萄糖浓度到2.5%, 并周期性地调整PH, 乳酸链球菌素的产量被增加, 而且通过添加肝浸出物到基质中可使乳酸链球菌素产量可增加到620IU/ml。泛酸钙比肝浸出物或B族维生素更有效, 必须具有一个超量的泛酸钙量(0.6ug/ml), 因为微生物学分析表明, 在葡萄糖加富培养基中, 泛酸钙被迅速利用并成为限制性因素。Hirsh通过用三种组分的缓冲系统(含乙酸盐, 柠檬酸盐和硫酸盐)取代周期性PH调整进一步提高乳酸链球菌素产量到1700IU/ml。

1971年, Egorov设计了一种简单的乳酸链球菌素生产的培养基, 他们制定一种培养基是由最佳浓度的玉米浸出物, 酪蛋白质水解物, 葡萄糖, KH2PO4和MgSO4组成, 该培养基能产大约2200IU/ml。在以后的报道中, 1976年Egorov等声称添加胸腺嘧啶、腺嘌呤、次黄嘌呤到生长培养基中刺激乳酸链球菌素和生物量的产生。然后, 乳酸链球菌素的产量比先前报道使用一种完全不同组分的培养基所产生的低。 1951年Hirsh和1977年Kozak和Dobrzanski都观察到, 将嘌呤和嘧啶加入他们各自的生长基质中都没有任何刺激作用。去掉MgSO4, 并不能明显改变乳酸链球菌素产量, 而1979年kozlova等注意到降低KH2PO4的浓度用NaOH维持PH接近中性, 引起乳酸链球菌素产量降低35-40%。这些作者设想KH2PO4不仅是一种缓冲剂, 而且还是微生物生长所需的K+的来源。1980年Baranova等随后用酶水解微生物生物量(主要是酵母)获得的富含蛋白质、维生素的氮原取代更贵的酪蛋白质水解物, 乳酸链球菌素的产量具有轻微的减少 ,而较低的酶水解物投入补偿了这些。

1977年KOZAK和DOBRANSKI描述了一种含最少的微生物生长和乳酸链球菌素产生的有机组分的合成培养基。它由九种氨基酸, 四种B族维生素, 葡萄糖和矿物盐组成。除了九种氨基酸, 其中六种存在于乳酸链球菌素分子中, Rozak和Dobrzanski还注意到无论单独或组合添加丝氨酸、脯氨酸, 半胱氨酸和胱氨酸都会增加乳酸链球菌素的产量而对其生长速率和最终生物量并没有任何影响。生物素刺激生长并明显增加乳酸链球菌素的产量。不幸的是他们提出的产量不能与其他人提出的相比较, 因为他们表达其结果的单位是乳酸链球菌素活性/每个菌落或乳酸链球菌素活性/每单位光密度。

在1957年Aplin和Barrett公司中Hauley和Hall的专利中, 全灭菌脱脂或再制牛奶被用于乳酸链球菌素的商业化生产, 而在以后1963年HALL的专利中一种修改后的牛奶培养基被利用, 这种培养基是用木瓜蛋白酶, 胃蛋白酶或胰蛋白酶水解牛奶中的蛋白质, 然后加热破坏酶制备而成的。沉淀蛋白质被去掉, 液态蛋白质被在115℃灭菌用于培养微生物。为了获得木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶的最佳活性, 牛奶的PH值被分别调到6.5,1.5, 7.8。

D: 培养条件

生长环境对乳酸链球菌素的产量和抗细菌谱具有明显的影响。 1951年Hirsh报道一种乳酸链球菌能产生不同类型的乳酸链球菌素, 这取决于生长的方式和条件。1952年Berridge等, 1976年Willimouskapelc等也观察到一种乳酸链球菌素制备物是由大量非常相近的多肽组成的, 其组成比例可根据条件的变化而改变。例如, 1949年, Berridge注意到: 由乳酸链球菌在30℃生长产生的乳酸链球菌素对乳脂链球菌和无链球菌有抑制作用, 而当在20℃培养时, 所产生的乳酸链球菌素对乳酸链球菌有活性,对无乳链球菌无作用。

正如1951年Hirsch指出的那样, 最高的乳酸链球菌素产量可通过连续调节PH接近中性来获得。他注意到: 乳酸链球菌素的产生直接与细胞生物量有关, 而通气拮抗乳酸链球菌的生长和乳酸链球菌素的产生。1955年, Hauley也观察到, 如果环境被调整维持微生物在其活性生长期保持单或双球菌形式, 将获得最佳产量。然而, 他提醒: 在最大量条件下(指PH)所生产的乳酸链球菌素不能保证与次大量条件下所生产的乳酸链球菌素具有相同的抗细菌性质。

典型的发酵条件是在28-30℃培养16-18小时, 连续或周期性调节PH在6.0-6.8之间, 除了调节PH或通气隔绝氧时, 其它时间不搅拌。

E: 产品的回收和纯化

1947年, Mattick和Hirsh通过用氯仿创造一种象橡胶一样的乳化状态从发酵液中浸出乳酸链球菌素。这种培养物被酸化到PH=2.0以释放与细胞相连的乳酸链球菌素, 然后, 这种无细胞上清液被调到PH=4.5, 并加5%氯仿和0.1%二辛基醇后强力搅拌。去掉橡胶一样的层, 加入冷无水乙醇以溶解氯仿和沉淀的乳酸链球菌素。离心收集沉淀的物质, 再溶解在50℃0.05N HCL中, 当搅拌时给液体表面吹热空气以去除残留氯仿。接下来进行一系列PH调整和乙醇浸提, 得到的物质进行冷冻干燥, 这些物质具有近2.0×106IU/g的活性。通过重复溶解在0.01N HCL中并用NaCl盐析可进一步纯化。1947年Berridge从通过再溶解在无水乙醇中并慢慢冷冻溶液结晶出了(Mattick和Hirrsh于1947年的制备物中)长丝状体。

1951年, Hirsh也努力通过吸附乳酸链球菌素到合成树脂柱上再利用80%的酸化乙醇洗脱来回收乳酸链球菌素, 尽管大多数乳酸链球菌素被回收, 洗脱物的纯度是不理想的。干基料的活形只有1.0×105IU/克, 比Mattick和Hirsh于1947年提出的用氯仿胶处理获得的产品的活性低。发泡方法的效果被进一步研究, 含5% CO2的氮气被鼓入培养液中, 所形成的泡沫被允许微微地移动到30°角置于培养基表面直径1英寸的玻璃管中, 收集到这个容器中的泡沫含有90%的乳酸链球菌素,这些泡沫含有生长培养基体积的1/10。

1957年Cheseman和Berridge使用一种组合的正丙醇和氯化钠的组合物从发酵液中回收乳酸链球菌素。丙醇首先溶解在酸化肉汤中, 然后再加入NaCl, 以减小丙醇和乳酸链球菌素的溶解性。正丙醇层含有从肉汤中分离出来的绝大部分乳酸链球菌素, 用虹吸管吸出。这一步骤被再次重复, 混合的丙醇层含有乳酸链球菌素的85%-100%。溶解正丙醇层在0.1N HCl中, 用过量的NaCl盐析出来, 形成相对较小体积的二层。上层富含丙醇, 含有乳酸链球菌素的1/2, 夹在上层和水溶性NaCl盐之间的灰色沉淀物中含有另外一半。 二表面间的沉淀物被用丁醇分成几部分, 最终用丙酮沉淀。干粉只有接近3.0×107IU/克的活性。对于富含丙酮层的处理步骤是很复杂的, 包括在丁醇乙酸系统的分离和大量丙酮沉淀步骤, 这种制备物的活性是2.8×107IU/克。

在1957年, Hauley和Hall的专利阐述中, Aplin和Barrett认为, 通过Hirsh 1951年提出的泡沫技术可以回收乳酸链球菌素。物理和化学分离技术以及浓缩、喷雾干燥和添加NaCl标准化可获得浓缩物。

F: 分 析

早在1934年, Gox使用甲基兰还原试验用于检测牛奶中的抑制性链球菌, 在这个实验中, 存在于牛奶中的微生物还原甲基兰成无色状态。但是, 如果产乳酸链球菌素的微生物存在, 还原的时间明显地增加。1957年Cheralier等也描述了一种实验, 用于检测牛奶中的抑制性链球菌。他们利用这样一个事实。某些微生物能够在相对较低的温度下生长。一种加富的琼脂培养基与实验条件下的牛奶和对乳酸链球菌素敏感的嗜热乳酸乳杆菌一起接种。平板在20℃培养1天, 允许乳酸链球菌素产生菌的形成。然后培养条件被转换为30℃, 当敏感菌生长时, 被附近的乳酸链球菌素产生菌所抑制。通过菌落周围的透明圈进行鉴定。

1947年, Mattick和Hirsh发展了一种消光溶液测定法来测定乳酸链球菌素的数量。一系列接种有溶血性的无乳链球菌菌株的试管, 在试验中加入稀释材料。这种试管在37℃培养16-20hr, 这些试管被用于检查生长, 用添加到最后一支不能发生生长试管中稀释度的倒数来计算效价。1950年Hirsch扩展了这种方法, 乳脂链球菌IP5被用作测试微生物,甲基兰的还原被用作生长指示剂。在相同的报道里, Hirsch也描述一种更复杂的迟滞期法, 使用无乳链球菌作为测试微生物。在以后的分析中, 迟滞期的长短与5-10IU/ml乳酸链球菌素浓度是线性相关的。

1952年, Berridge和Barre的浊度法被Hirsch在1966年进行了修改。试验微生物是乳脂链球菌, 被接种到含有各种稀释度乳酸链球菌素的一系列试管中, 试管被培养2.5-3hr,然后通过添加一种消毒剂来停止生长。测定OD600并对乳酸链球菌素浓度的log10标点建立一条标准曲线。试验的敏感度是0.04-0.4IU/ml, 但是, 只能分析澄清的溶液。

传统的水平琼脂扩散技术只具有有限的用途。因为乳酸链球菌素通过琼脂的扩散是困难的。为了克服这种困难, Mocguot和Lefebvre于1956年将土温80结合进琼脂培养基中。冷冻接种过的平板, 过夜允许乳酸链球菌素通过琼脂扩散。然后培养接种平板, 测定试验微生物的抑菌圈。 Franmer和Fouler于1964年在分析培养基中使用1%土温20, 增加了乳酸链球菌素的扩散率。因此排除了必需的前扩散步骤。使用藤黄微球菌作为测试微生物的这种方法能测定0.5-10IU/ml的乳酸链球菌素, 存在雾浊的样品也没问题。这方法特别用于食品中乳酸链球菌素的定量测定。合适地控制被用于这方法以补偿食品浸出物中存在的干扰物质。

1964年, Framer和Fouler也描述了一种半定量的反相步骤, 该步骤使用热振荡嗜热脂肪芽孢杆菌孢子能被用于平常样品的筛选。

1964年, Jtumbo等发展了一种敏感的分析罐藏食品中残留乳酸链球菌素的微量方法,该试验是基于热损伤嗜热脂肪芽孢杆菌的孢子对乳酸链球菌素的敏感性。作者强调, 小于0.3IU乳酸链球菌素在每克食品中都能被非常精确地测定出来。

 
    发酵工业网微信公众号
     
    更多>同类技术资料
    0相关评论

    推荐图文
    推荐技术资料
    网站首页  |  2021年发酵工业网第1期电子周刊  |  2019年第13期  |  设备维修  |  关于我们  |  联系方式  |  付款方式  |  广告合作  |  网站地图  |  排名推广  |  广告服务  |  积分换礼  |  网站留言  |  RSS订阅  |  违规举报  |  鄂ICP备2024036847号-1
    Powered By DESTOON