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转录因子CREA的敲除对黑曲霉形态和分泌β-葡萄糖苷酶的影响

日期：2026-07-14 来源：生物技术通报浏览：32 评论：0

核心提示：我国的农林废弃物产量巨大，将其富含葡萄糖的纤维素经生物转化用于高价值生物基产品，已成为“双碳”战略下绿色生物制造行业的研究热点［24-25］。纤维素糖化必须经过内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶共同作用，其中，β-葡萄糖苷酶是重要的限速酶。目前，里氏木霉作为商业化纤维素降解酶的主要来源，其中分解纤维二糖的BGL占比不到1%，不利于纤维素水解糖的高效制备［26］。因此，BGL的高效表达对于纤维素降解酶制剂的研发和应用尤为重要。鉴于CREA转录因子在调控丝状真菌的纤维素酶表达过程中起主导作用［27］，

目的在黑曲霉中敲除转录因子CREA，探究其对菌丝发育和β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase, BGL）表达的调控作用，为开发高产BGL的细胞工厂提供有效的调控改造靶点。

方法以黑曲霉菌株An-1为研究对象，构建敲除creA基因的操作质粒和供体片段。经原生质体转化、抗性筛选和菌丝PCR验证，利用CRISPR-Cas9基因编辑技术，获得敲除菌株ΔcreA。通过平板培养和摇瓶发酵，分别考察转录因子CREA对菌体形态和产BGL的影响，并在不同浓度葡萄糖下，探究碳阻遏效应对BGL生物合成的影响。

结果在黑曲霉菌株An-1中对creA基因进行了精准敲除，获得缺失突变菌株ΔcreA。与野生型菌株相比，ΔcreA菌株的菌落形态呈现车轮状褶皱，在七叶苷显色平板上表现出较强的β-葡萄糖苷酶分泌能力。以纤维二糖和p-硝基苯酚-α-D-吡喃葡萄糖苷为底物，ΔcreA菌株的BGL活性分别为野生型菌株的1.5倍和1.8倍。荧光定量PCR显示，creA的敲除使bglA基因的表达量提升了8.4倍。在添加不同浓度葡萄糖的发酵过程中，ΔcreA菌株的酶活水平始终高于野生型，表现出脱碳阻遏效应。

结论CREA转录因子调控了黑曲霉的菌丝发育和BGL表达，其敲除减轻了碳阻遏效应，提高了黑曲霉产BGL的能力，为调控改造黑曲霉以优化BGL的生产性能提供了理论支持。

关键词黑曲霉；β-葡萄糖苷酶；转录因子；CRISPR-Cas9；基因敲除；碳阻遏效应

引用本文：程慧娟,王昕,胡骏鹏,等.转录因子CREA的敲除对黑曲霉形态和分泌β-葡萄糖苷酶的影响[J].生物技术通报,2025. DOI:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2024-1125.

农林废弃物等木质纤维素类原料含有丰富的纤维素成分，是由葡萄糖单元通过β（1→4）键连接而成的线性多糖^［1］。纤维素经内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶（β-glucosidases, BGL）水解为葡萄糖，是微生物可利用的丰富廉价碳源，具有成为淀粉发酵原料的良好替代品的潜力^［2］。目前，木质纤维素水解液逐渐被用于生产生物能源、生物基化学品和生物基材料，如乙醇、乳酸、丁二酸、3-羟基丙酸、PLA、PHA等^［3-5］。因此，实现纤维素的高效酶解将打通农林业和生物制造行业的产业链，向上促进农林废弃利用、减碳环保，向下减少粮食基原料依赖，不与人争粮，可推动生物制造产业降本增效，促进生物经济的绿色可持续发展。

BGL可有效解除纤维二糖积累对纤维素内切酶和外切酶的抑制作用，成为纤维素糖化过程的限速酶^［6-7］。自然界中许多降解纤维素的微生物能够产生β-葡萄糖苷酶，其中黑曲霉的产酶水平较高、降解纤维二糖的性能较好，被作为重要酶源组份，用于提升里氏木霉纤维素酶的纤维二糖降解能力^［8］。然而，黑曲霉的基因转录、蛋白翻译、修饰、折叠与运输各个环节均受到正、负转录调控因子的制约平衡，使之产酶能力受到局限^［9］。碳代谢阻遏相关调控因子CREA广泛存在于草酸青霉、里氏木霉、粗糙脉孢菌等多种真菌中，主要通过碳阻遏效应（carbon catabolite repression, CCR）调控纤维素分解酶的表达^［10-12］。CREA是一种C₂H₂型锌指蛋白，它的DNA结合域能够特异性地识别并结合到纤维素酶等降解酶基因启动子区域的特定DNA序列上，阻止RNA聚合酶的结合和转录起始复合物的形成，从而抑制这些基因的转录表达^［13-14］。在核盘菌和构巢曲霉中，CREA是组成型表达并存在于胞浆中，当纤维素降解为大量葡萄糖后，CREA转移至细胞核，从而抑制纤维素酶系基因的表达^［15-16］。研究表明，在草酸青霉、里氏木霉中，CREA的失活缓解了碳阻遏效应，分别使BGL的酶活从1.8 U/mL提升至2.5 U/mL、1.4 U/mL提升至2.0 U/mL^{［12, 17］}，CREA由此成为优化丝状真菌中BGL等纤维素酶表达的重要调控靶点。另外，在粗糙脉孢菌、构巢曲霉中creA的敲除延迟了孢子形成，缩短了菌丝长度，菌落形态呈致密型改变，说明转录因子CREA参与了菌丝发育过程的调控^［18-19］，但在黑曲霉的相关研究尚未见报道。

为了探索转录因子CREA对黑曲霉形态和产BGL能力的调控作用，本研究通过生物信息学分析，发现不同丝状真菌中的CREA有着一定的保守性；然后选择由本实验室自主筛选出的具有一定产BGL能力的非模式黑曲霉菌株An-1为研究对象，使用CRISPR-Cas9基因编辑技术，对creA基因进行精准敲除；接着，对所构建的敲除菌株ΔcreA，分别进行形态和产BGL性能的评价，以及脱碳阻遏效应的影响。本研究将为高产BGL工程黑曲霉的调控改造提供有效靶点和理性策略。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、质粒与引物

本研究的黑曲霉菌株An-1为实验室筛选，保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2024768。大肠杆菌DH5α采购于南京诺唯赞生物科技有限公司。pFC332质粒采购于湖南丰晖生物科技有限公司。pUC-sgRNA采购于南京金唯智生物科技有限公司。引物由上海生工生物工程有限公司合成，序列见表1。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.1.2 试剂

限制性内切核酸酶Bgl Ⅱ购自NEB公司；质粒提取试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、2×Rapid Taq Master Mix、2×Phanta Max Master Mix （Dye Plus）、DL5000 DNA Marker、Ultra Gel Red （10 000×）和Hiscript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit（+gDNA wiper）购自南京诺唯赞；琼脂糖凝胶购自上海生工生物工程有限公司；SDS-PAGE凝胶快速配置试剂盒、50×TAE、考马斯亮蓝超快染色液购自碧云天生物公司；无缝克隆试剂盒购自都友生物公司；基因组提取试剂盒、潮霉素、蜗牛酶和溶菌酶购自北京索莱宝有限公司；纤维素酶购自麦克林有限公司；葡萄糖测定试剂盒购自南京建成有限公司；总RNA提取试剂购自福建飞净生物科技有限公司；2 × qPCR Mix（Green）购自上海李记生物科技有限公司。

1.1.3 培养基

PDA培养基：马铃薯200 g/L；葡萄糖20 g/L。用于转化子筛选时加入潮霉素B，终浓度为300 μg/mL。七叶苷固体培养基：羧甲基纤维素钠10 g/L；七叶苷3 g/L；柠檬酸铁铵5 g/L；(NH₄)₂SO₄ 2 g/L；KH₂PO₄ 1 g/L；MgSO₄·7H₂O 0.5 g/L；酵母浸粉1 g/L；琼脂20 g/L；加水至1L，自然pH。CD高渗固态培养基：蔗糖342 g/L；NaNO₃ 3 g/L；KCl 2 g/L；MgSO₄·7H₂O 0.5 g/L；K₂HPO₄·3H₂O 1 g/L；FeSO₄·7H₂O 0.01 g/L；琼脂20 g/L；加水至1 L，pH5.5。液体生长培养基：酵母浸粉6 g/L；蛋白胨3 g/L；葡萄糖20 g/L；KH₂PO₄ 0.5 g/L；(NH₄)₂SO₄ 0.5 g/L；MgSO₄·7H₂O 1 g/L；加水至1L，用于提取基因组时培养菌体。种子液培养基：羧甲基纤维素钠15 g/L；(NH₄)₂SO₄ 1.6 g/L；KH₂PO₄ 1 g/L；MgSO₄∙7H₂O 0.5 g/L；酵母浸粉1 g/L；Mandels微量元素0.1 mL/L；吐温80 3 mL/L；加水至1 L。发酵培养基：（NH₄）₂SO₄ 10 g/L；尿素2.5 g/L；KH₂PO₄ 2.5 g/L；MgSO₄·7H₂O 1 g/L；槐糖苷化合物7 g/L；加水至1 L。CaCl₂·2H₂O 1.5 g/L（发酵48 h左右加入）。

1.2 方法

1.2.1 黑曲霉CREA蛋白的生物信息学分析

黑曲霉的CREA氨基酸序列来自于全基因组测序数据库，其他不同来源的CREA氨基酸序列从NCBI网站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）下载获得，使用MEGA11软件选用Neighbor-joining法构建系统进化树，参数Bootstrap method选择1 000，校正方法使用Poisson model，对黑曲霉CREA蛋白进行生信分析。

1.2.2靶位点sgRNA表达盒及CRISPR-Cas9靶向敲除质粒的构建

靶位点通过CHOPCHOP（http：//chopchop.cbu.uib.no/）在线设计，将靶位点设计进引物sgRNA-F和5SrRNA-R中，以黑曲霉基因组为模板，5S rRNA-F/R为引物扩增含靶位点的5S rRNA启动子序列，以pUC-sgRNA质粒为模版，sgRNA-F/R为引物扩增含靶位点的sgRNA序列。上述扩增产物经琼脂糖凝胶切胶纯化，按摩尔比例1∶1的比例为模板，以5S rRNA-F/sgRNA-R为引物，将5S rRNA启动子与sgRNA序列融合PCR，并将产物进行纯化处理。

pFC332质粒经Bgl Ⅱ酶切处理，酶切产物进行纯化。在无缝克隆体系中加入200 ng的酶切载体与30 ng的sgRNA表达盒，于50 ℃下反应15 min后，进行大肠杆菌转化。待氨苄抗生素平板上出现转化子后，挑取数个进行培养获得菌液，以pFC332-F/R为引物，菌液PCR验证CRISPR-Cas9靶向敲除质粒，条带正确菌株送至生工生物公司测序。

1.2.3 供体片段的构建

无选择标记的敲除供体DNA片段选取靶位点两端的左右各500 bp的同源臂，分别以gtsy-F/R和gtxy-F/R为引物扩增上、下同源臂，进一步将纯化的PCR产物使用引物gtsy-F/gtxy-R进行融合PCR，获得供体DNA片段，使用醋酸钠-乙醇沉淀法纯化回收。

1.2.4原生质体转化及转化子筛选

原生质体转化：黑曲霉的原生质体转化方法参照PEG介导原生质体转化方法并进行了优化^［20］，将菌液涂布于潮霉素抗性CD高渗固体培平板上，28 ℃倒置培养5-7 d。

转化子筛选：挑取CD高渗固体平板上转化子于潮霉素抗性PDA固体平板上，28 ℃培养2-3 d，挑取适量菌丝于含有45 µL 2 mol/L NaOH溶液的离心管中，振荡使菌丝分散，95 ℃反应10 min，待冷却后加入加5 µL 2M Tris-HCl溶液，振荡使酸碱中和，12 000 r/min离心10 min，吸取2 µL上清作模板，以creAYZ-F/gtxy-R为引物PCR检测creA基因的敲除，条带大小正确的产物送上海生工基因测序验或验证。

1.2.5 敲除菌株的形态特征

取1 µL新鲜制备的孢子悬液点至PDA固体平板上，28 ℃静置培养，分别记录48 h、60 h和72 h的菌落形态变化。另取1 µL新鲜孢子悬液点至七叶苷固体平板上，28 ℃静置培养，分别测量48 h、60 h和72 h的菌落及黑色晕圈的直径。

1.2.6敲除菌株的发酵及纤维素酶活测定

将黑曲霉接种于PDA固体平板上，28 ℃倒置培养4 d，用0.9% NaCl溶液制作孢子悬液^［21］。利用血球计数板计数，取约1×10⁷个孢子接种量接种于种子培养基，30 ℃、200 r/min振荡培养24 h，以10%的接种量转接至以0.7%槐糖苷化合物诱导产酶的发酵培养基中，30 ℃、200 r/min振荡培养。

取适量发酵液，12 000 r/min离心10 min后取上清进行酶活测定。以纤维二糖和p-硝基苯酚-α-D-吡喃葡萄糖苷（p-NPG）两种底物测定β-葡萄糖苷酶活（BGL）^［22］。以1% CMC-Na为底物进行内切葡聚糖苷酶（EG）酶活的测定^［23］。底物更换成对硝基苯基-β-D-纤维二糖苷（p-NPC）测定外切葡聚糖苷酶（CBH）酶活。

1.2.7 敲除creA对黑曲霉BGL产纤维素酶基因表达影响

取100 mg菌丝体，采用Trizol法提取总RNA，经琼脂糖凝胶电泳检验RNA的完整性，并测定RNA浓度。将1 µg RNA去除基因组DNA后，进行反转录合成cDNA。以18S rDNA为内参基因，对主要纤维素酶基因（egl1、cbh1和bglA）进行相对荧光定量的检测，结果采用2^-△△CT法进行分析。

1.2.8 敲除creA对脱碳代谢物阻遏的影响

参考1.2.6的方法，在发酵培养基中分别添加1、3、5、7、9 g/L的葡萄糖进行发酵，测定相应的β-葡萄糖苷酶活（BGL）。

2 结果

2.1 CREA的生信分析

CREA同系物存在于多种丝状真菌中，将黑曲霉中的CREA与其他9种丝状真菌的同系物进行分析。如图1所示，根据系统进化树结果分析，本研究所选取的10个CREA主要分成3个分支：AoCreA、AnCreA、AfCreA、AaCreA、TrCreA、TgCreA组成一个分支，其中米曲霉AoCreA和黑曲霉AnCreA之间的同源性达到100%；AdCreA、PdCreA、PoCreA组成一个分支，青霉菌彼此之间的同源性为99%；NcCreA是一个分支，与其他两个分支的同源性较低。

图1 CREA氨基酸序列进化树分析Fig. 1 Evolutionary tree analysis of CREA amino acid sequences

AoCreA：米曲霉的CREA； AnCreA：黑曲霉的CREA； AfCreA：烟曲霉的CREA； AaCreA：棘孢曲霉的CREA；TrCreA：里氏木霉的CREA；TgCreA：盖姆斯木霉的CREA；AdCreA：构巢曲霉的CREA；PdCreA：斜卧青霉的CREA；PoCreA：草酸青霉的CREA；NcCreA：粗糙脉孢菌的CREA

AoCreA: CREA in Aspergillus oryzae; AnCreA: CREA in Aspergillus niger; AfCreA: CREA in Aspergillus fumigatus; AaCreA: CREA in Aspergillus aculeatus; TrCreA: CREA in Trichoderma reesei; TgCreA: CREA in Trichoderma gamsii; AdCreA: CREA in Aspergillus nidulans; PdCreA: CREA in Penicillium decumens; PoCreA: CREA in Penicillium oxalicum; NcCreA: CREA in Neurospora crassa

2.2 用于敲除creA基因的sgRNA表达盒、靶向质粒的构建与供体片段的设计与构建

考虑到在线设计的靶位点可能存在脱靶效应而影响编辑效率，在此选择creA基因的3个评分较高且无特殊结构的靶位点。对于sgRNA的表达，使用5S rRNA启动子进行驱动。起初，采用的是截短的5S rRNA启动子（片段长度在118 bp），所构建的sgRNA表达盒与pFC332上的Cas9配套使用，无法成功实现黑曲霉菌株基因编辑。随后，采用全长的5S rRNA启动子（片段长度在457 bp）进行表达sgRNA。通过在引物中添加20 bp靶位点序列，经融合PCR获得5S rRNA-target-sgRNA表达盒，总长度为559 bp，如图2-A和D所示。

图2 CRISPR-Cas9靶向质粒及供体DNA的构建Fig. 2 Construction of CRISPR-Cas9 targeting plasmid and donor DNA

A：sgRNA表达盒的构建；B：pFC332-target-sgRNA的构建；C：无选择标记供体DNA片段的构建；D-F：sgRNA表达盒、pFC332-target-sgRNA质粒和供体DNA片段的PCR检测

A: Construction of sgRNA expression cassette; B: construction of pFC332-target-sgRNA; C: construction of DNA donor; D-F: PCR detection of sgRNA expression cassette, pFC332-target-sgRNA and DNA donor, respectively

pFC332质粒是商业化的丝状真菌基因编辑质粒，在黑曲霉中表现潮霉素抗性，而出发黑曲霉菌株在潮霉素（300 µg/mL）的情况下完全无法生长，由此本研究直接将该质粒用于Cas9和sgRNA的共表达。经过Bgl Ⅱ单酶切后获得线性化载体（15 kb），将5S rRNA-target-sgRNA表达盒片段通过无缝克隆的方式与载体连接，最终成功构建共表达载体（pFC332-5SrRNA-target-sgRNA），如图2中的B和E所示。本研究选用的是线性供体片段，使用的是靶位点左右各500 bp同源臂，经融合PCR获得长度为1 kb的敲除供体片段，结果如图2-C和F所示。

2.3 敲除菌株的筛选和验证

通过PEG介导的原生质体转化法，将靶向质粒与敲除供体共同转化至黑曲霉菌株中，随后将潮霉素抗性CD高渗固体培养基上的转化子，进行传代转接于抗性的PDA平板上。待转化子长出后挑取菌丝，利用碱裂解法破菌后，采用CreAYZ-F/gtxy-R引物对转化子进行PCR检测，结果显示，未敲除成功的片段长度在2.1 kb，而敲除creA基因的片段长度仅有1.1 kb（图3-A）。经测序确认，creA基因被成功敲除（图3-B），并将此敲除菌株命名为ΔcreA。

图3 黑曲霉中creA基因的敲除Fig. 3 Knockout of the creA gene in A. niger

A：creA基因编辑示意图及PCR敲除验证；B：creA基因敲除测序图

A: Schematic diagram of creA gene editing and verification of PCR knockout; B: Sequencing image of creA gene knockout

2.4 敲除CREA对黑曲霉菌体形态的影响

在转化子转接过程中，观察到敲除菌株ΔcreA的形态发生了显著变化。为了进一步探究这一现象，将敲除菌株ΔcreA与野生型菌株分别接种于PDA固体平板上，并记录其生长情况。实验结果显示（图4-A），在培养48 h后，野生型菌株的生长速度较快，所形成的黑色孢子较致密；相比之下，敲除菌株ΔcreA的菌落表面开始出现褶皱，呈现车轮状结构，并伴随少量黑色孢子的产生。值得注意的是，尽管野生型菌株的直径有所增大，但其整体形态未见明显异常。培养72 h，野生型菌株的菌落直径明显大于敲除菌株ΔcreA，在平板上呈平面发散状生长，而敲除菌株ΔcreA则在PDA平板上表面形成凸起，且随着菌落的生长，其直径变化趋于平缓。

图4 黑曲霉菌体在不同培养基中形态的差异Fig. 4 Differences in the morphologies of A. niger in different media

A：PDA固体平板分别培养48/60/72 h的菌体形态；B：七叶苷固体平板分别培养48/60/72 h的菌体形态；C：液体生长培养基菌体形态

A: Cell morphology in PDA solid plates cultured for 48/60/72 h, respectively. B: Cell morphology in esculin solid plates cultured for 48/60/72 h, respectively. C: Cell morphology in liquid growth medium

七叶苷在BGL的作用下被分解为葡萄糖和七叶素，后者与培养基中的柠檬酸铁铵Fe²⁺反应生成黑色化合物，使培养基呈现黑色。黑色透明圈与菌株直径的比值越大，表明菌株分泌BGL的能力越强。通过将敲除菌株ΔcreA与野生型菌株分别接种于七叶苷固体平板上并观察其生长情况，结果发现：在培养48 h，野生型菌株的黑色透明圈与菌株直径比为1.82，而ΔcreA为2.5；60 h该比值分别为1.66和2.32；72 h该比值分别为1.54和2.05（图4-B）。液体培养基中，野生菌株的菌球大而稀疏，敲除菌株ΔcreA菌球小而致密，两者形态差异较大（图4-C）。

2.5 敲除CREA对黑曲霉产BGL的影响

以纤维二糖为底物测定BGL酶活，如图5-A显示，ΔcreA酶活始终高于野生菌株，第7天时ΔcreA的酶活在9.32 U/mL，出发菌株仅有6.47 U/mL，ΔcreA较野生株相比BGL酶活提高了近1.5倍。以p-NPG为底物测定BGL酶活，如图5-B显示，与纤维二糖为底物时所测趋势一致，ΔcreA酶活始终高于野生菌株，在发酵第7天时，ΔcreA的酶活在6.30 U/mL，出发菌株仅有3.51 U/mL，ΔcreA较野生菌株相比BGL酶活提高了近1.8倍。

图5 creA的敲除对不同酶酶活的影响Fig. 5 Effects of creA knockout on the enzymatic activities of different enzymes

A：纤维二糖为底物测定BGL酶活；B：p-NPG为底物测定BGL酶活；C：p-NPC为底物测定CBH酶活；D：CMC-Na为底物测定EG酶活

A: BGL enzyme activity determined by cellobiose as substrate. B: BGL enzyme activity assayed with p-NPG as substrate. C: CBH enzyme activity assayed with p-NPC as substrate. D: EG enzyme activity assayed by CMC-Na as substrate

此外，本研究对CBH酶活和EG酶活进行了测定。结果如图5-C-D显示，发酵结束时ΔcreA与野生型菌株的CBH酶活相似，约为0.28 U/mL，表明敲除creA基因对CBH酶活的影响较小。在EG酶活方面，ΔcreA菌株的酶活水平始终高于野生型菌株，但酶活值均处于较低水平，分别为0.12 U/mL 、0.17 U/mL。

2.6 敲除creA对黑曲霉BGL和其他纤维素酶基因表达影响

荧光定量PCR对纤维素酶各组分基因（bglA、cbh1、egl1）的转录水平进行测定，结果如图6-A所示，ΔcreA菌株的纤维素酶各组分基因转录量较野生菌株分别提升了8.4倍、7.3倍、4.2倍，表达量均有上调。其中，bglA基因与egl1基因的表达量提升与2.5中的BGL和EG酶活增加测定结果一致，而cbh1基因表达量虽有上升，但CBH酶活却增加不明显，这可能与CBH的翻译或运输过程受阻有关。随后取发酵第7天发酵液，经处理后进行SDS-凝胶电泳，结果如图6-B所示，相较于野生菌株An-1，敲除菌株ΔcreA的电泳条带较深。然而，ΔcreA与An-1的发酵液上清中蛋白含量差别不大，这可能是由于An-1发酵液中的蛋白被降解为短肽所致。ΔcreA菌株的纤维二糖比酶活为4.97 U/mg，高于An-1菌株3.19 U/mg的比酶活（图6-C）。另外，ΔcreA的菌株在95-150 kD之间出现了约120 kD的BGLA条带。综上得知，creA基因的敲除引起了bglA基因的表达量增加，从而导致了BGL酶活增加。

图6 creA的敲除对表达量及蛋白的影响Fig. 6 Effects of creA knockout on expression and protein

A：bglA、cbh1、egl1基因的转录水平；B：第7 d发酵液上清的SDS-PAGE，1-3代表△creA菌株发酵样品，4-6代表野生菌株发酵样品；C：第7 d发酵液的上清蛋白含量及BGL比酶活（以纤维二糖为底物）

A: Transcription levels of bglA, cbh1, and egl1 genes; B: SDS-PAGE on the 7 th day of fermentation, 1-3 refer to the fermented samples of △creA strain, and 4-6 refer to the fermentation samples of wild strains. C: Protein content and specific activity of BGL (cellobiose as substrate) on the fermentation of day 7

2.7 敲除creA对脱碳阻遏的影响

转录因子CREA在碳代谢阻遏效应中起主导作用，本部分探究了在发酵过程中葡萄糖的添加对黑曲霉的产酶影响。图7显示，相比于敲除菌株ΔcreA，野生菌株在发酵过程中受葡萄糖的影响较大。在发酵中期（4-6 d），出发菌株的酶活随葡萄糖的增加出现了明显下降，在9 g/L的高浓度葡萄糖作用下，检测不到相应酶活；发酵后期（7 d），随着葡萄糖的消耗，碳阻遏效应有所缓解，使酶活水平有所回升。相比之下，敲除菌株ΔcreA在不同浓度葡萄糖下的酶活水平始终高于出发菌株，且酶活降低趋势较为缓和（图7）。以上结果表明，敲除creA有效缓解了碳阻遏效应，优化了黑曲霉发酵生产BGL性能（图8）。

图7 不同葡萄糖浓度下creA的敲除对黑曲霉产BGL的影响Fig. 7 Effects of creA knockout on BGL production by A. niger at different glucose concentrations

A：发酵4 d的酶活水平；B：发酵5 d的酶活水平；C：发酵6 d的酶活水平；D：发酵7 d的酶活水平

A: Enzyme activity level after 4 days of fermentation. B: Enzyme activity level after 5 days of fermentation. C: Enzyme activity level after 6 days of fermentation. D: Enzyme activity level for 7 days of fermentation

图8 敲除creA促进黑曲霉发酵生产BGLFig. 8 Knockout of creA promotes the production of BGL in A. niger

3 讨论

我国的农林废弃物产量巨大，将其富含葡萄糖的纤维素经生物转化用于高价值生物基产品，已成为“双碳”战略下绿色生物制造行业的研究热点^［24-25］。纤维素糖化必须经过内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶共同作用，其中，β-葡萄糖苷酶是重要的限速酶。目前，里氏木霉作为商业化纤维素降解酶的主要来源，其中分解纤维二糖的BGL占比不到1%，不利于纤维素水解糖的高效制备^［26］。因此，BGL的高效表达对于纤维素降解酶制剂的研发和应用尤为重要。鉴于CREA转录因子在调控丝状真菌的纤维素酶表达过程中起主导作用^［27］，本研究选择在BGL的主要生产者黑曲霉中，进一步探讨CREA转录因子的调控作用。

米曲霉在液体发酵水平上几乎检测不到BGL酶活，CREA的缺失使其酶活提升至0.6 U/干重（g），在利用麦麸进行固态发酵时，CREA缺失菌株的酶活比野生菌株增加了6倍^［28］。系统进化树分析发现，转录因子CREA在曲霉属中具有较高的相似性，其中黑曲霉与米曲霉的CREA同源性高达99%。因此，转录因子CREA可能会影响黑曲霉中BGL的生物合成。

CREA作为全局调控因子，在调控丝状真菌的菌丝生长和分化中具有重要作用。例如，在草酸青霉、里氏木霉中creA基因的缺失均会影响菌丝形态与孢子发育^{［17, 29］}。本研究在敲除黑曲霉的creA基因后，菌体形态发生明显变化。有意思的是，虽然ΔcreA菌株在平板培养时展现出菌丝发育迟缓，但是ΔcreA菌株与野生型菌株在发酵培养基中的菌体量没有展示出明显差异，这与米曲霉敲除菌株在固、液体中的生长现象一致^［28］。黑曲霉的形态会影响产酶效率，菌丝体粒径越小越有利于营养物质的接触和产物的释放，例如，黑曲霉SKAN1015通过添加硅酸盐微粒控制菌丝体形态，有效提升了β-呋喃果糖苷酶的酶活^［30］。creA的敲除减小了黑曲霉An-1菌丝体的粒径，这或许是增加BGL酶活的原因之一。

在里氏木霉中异源表达黑曲霉的bglA基因时，相应BGLA的蛋白条带约为120 kD^［31］。本研究发现，creA的敲除使黑曲霉发酵液上清出现了95-150 kD之间（约120 kD位置）的蛋白条带，而且bglA基因的表达量也出现了提升。因此，bglA的表达量增加引起了ΔcreA菌株中BGL酶活的上升。在产生纤维素酶的丝状真菌中，当易于代谢的碳源（如葡萄糖）存在时，CREA会抑制其他较难代谢的碳源利用，产生碳代谢阻遏效应，抑制纤维素酶的产生^［32］。里氏木霉RUT-C30通过诱变手段缺失了CREA部分序列，草酸青霉ΔcreA则是直接敲除creA基因，两者均表现出脱碳代谢物阻遏效应，即在葡萄糖存在时具有纤维素酶合成能力。然而，里氏木霉RUT-C30和草酸青霉ΔcreA的BGL酶活水平仅有2.0-2.5 U/mL^{［12, 17］}。相比之下，由于黑曲霉在生物合成BGL方面具有优势，本研究所构建的黑曲霉ΔcreA不仅具有良好的脱碳阻遏效应，而且酶活水平达到了9.32 U/mL，展示出较高的BGL酶活。

与前人研究相比，本研究在多个方面取得了新的进展。首先，本研究首次在黑曲霉中利用基因组编辑精准敲除了creA基因，并系统地评估了其对菌株形态、纤维素酶分泌能力和BGL酶活的影响。此前，虽然已有研究在草酸青霉、里氏木霉等真菌中敲除了CREA基因，并观察到类似的正向效应，但这些研究主要集中于BGL产量较低的模式生物上。本研究则将目光投向了自主筛选的非模式黑曲霉，进一步扩展了CREA敲除策略的适用范围。其次，本研究不仅验证了敲除creA对提升BGL酶活的调控作用，还深入探讨了其对脱碳阻遏效应的缓解作用，为理解黑曲霉中碳代谢调控机制提供了新的视角。另外，本研究为黑曲霉的基因工程改造提供了新的靶点和策略选择，未来研究可以进一步组合操纵CREA与其他关键转录因子，以及优化工程菌株的发酵工艺条件，以实现更高水平的BGL酶活。

4 结论

本研究利用CRISPR-Cas9基因编辑技术成功构建了一株敲除菌株ΔcreA，通过形态学分析和BGL酶活评价发现，转录因子CREA在黑曲霉菌丝发育和分泌BGL过程中发挥了关键作用。具体表现为，碳代谢阻遏因子CREA的缺失导致了黑曲霉菌丝发育迟缓，平板形态呈现出现褶皱和车轮状结构。七叶苷平板显色与摇瓶发酵，证实了CREA的敲除增强了黑曲霉合成BGL的能力。此外，敲除菌株ΔcreA分泌BGL受葡萄糖的干扰较小，展现出脱碳阻遏效应。

标签：

葡萄糖苷酶

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