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重组鲁西黄牛干扰素融合蛋白的表达及其抗病毒活性研究

   日期:2015-01-16     来源:网络    浏览:1379    评论:0    
核心提示:通过PCR从鲁西黄牛(Yellow cattle)基因组DNA中克隆了 a干扰素(BoIFN-a)基因,并插入到pET32a +中,构建成重 组原核表达质粒PET32a+/BoIFN-a,进行测序和诱导表达。测序结果表明,鲁西黄牛IFN-a基因全长498个核苷酸,含一个开 放阅读框(ORF),编码166个氨基酸的成熟蛋白,与已报道的牛a干扰素C亚型氨基酸组成同源性为97.6%。表达产物经 SDS-PAGE分析,表达出40kD的融合蛋白,表达量占菌体总蛋白的26.7%。表达产物经镍离子螯合次氨基三乙酸(Ni
  
 
 
    通过PCR从鲁西黄牛(Yellow cattle)基因组DNA中克隆了 a干扰素(BoIFN-a)基因,并插入到pET32a +中,构建成重 组原核表达质粒PET32a+/BoIFN-a,进行测序和诱导表达。测序结果表明,鲁西黄牛IFN-a基因全长498个核苷酸,含一个开 放阅读框(ORF),编码166个氨基酸的成熟蛋白,与已报道的牛a干扰素C亚型氨基酸组成同源性为97.6%。表达产物经 SDS-PAGE分析,表达出40kD的融合蛋白,表达量占菌体总蛋白的26.7%。表达产物经镍离子螯合次氨基三乙酸(Ni-NTA)亲 和层析纯化,纯化产物进行复性后在MDBK/VSV上的活性为5 x 105u/mg。重组牛IFN-a( rBoIFN-a)对牛轮状病毒(BRV)有一定 的抑制作用,抗BRV病毒活性为1.5xl(fu/mg。结果显示从鲁西黄牛中克隆了 IFN-a基因的一种新亚型,即BoIFN-aC2,并实 现了高效表达,获得了具有较高抗病毒活性的重组干扰素产物,为重组牛干扰素的开发奠定了基础。
 
    干扰素(interferon,IFN)是一类具有高活性,多功能的蛋白,具有广谱抗病毒,抗肿瘤及免疫调节功能[1]。牛干扰素分为I型和"型,其中I型干扰素 又分为a、、W、亚型,均为无内含子的单拷贝或多 拷贝基因,并具有广谱抗病毒作用[,]。以人IFN-« 基因为探针从牛的cDNA文库中克隆了牛IFN-a基 因(BoIFN-a),推测BoIFN-#至少有10 ~ 12个亚型, 并测序了其中A、B、C、D亚型[3,]。Chaplin[5]等 (1996)从病毒感染的肠上皮细胞中克隆了 BoIFN-a E亚型,并进行了重组表达研究,Paul[6]等(1996)克 隆了 G、F、H亚型,史喜菊等[7](2003)重组表达了 I、 J亚型。
    近年来,由于病毒感染引发的奶牛传染性疾病 发病率明显增加,给我国奶牛养殖业造成了较大危 害。而相关重组牛干扰素在抗水泡性口炎病毒,口 蹄疫病毒,牛病毒性腹泻病毒,呼吸道合胞体病毒研 究中均有较好效果[8_11]。为获得具有自主知识产权 的牛重组干扰素类制品,本文克隆了鲁西黄牛IFN-« 基因,重组到PET32a( + )表达载体中,构建成重组 原核表达质粒pET32a( + )/BoIFN-a,并在大肠杆菌 中进行高效表达研究,纯化了表达产物并进行了抗 病毒活性分析。
1材料和方法
1.1试验材料
1.1.1载体、细胞、病毒:PMD18-T载体购自 TaKaRa 公司;PET32a ( + )载体与 BL21 ( DE3 )购自 Novagen公司;水泡性口炎病毒(VSV )、牛轮状病毒 (BRV)、牛胎肾细胞(MDBK)购自中国兽医药品检定 所;重组人a干扰素购自山东金泰生物工程有限公 司。
1.1.2工具酶、试剂:各种工具酶购自TaKaRa公 司;DMEM培养基为GIBC0产品;回收试剂盒购自 u-gene公司;Ni-NTA纯化柱购自QIAGEN公司。
1.2方法
1.2.1引物:根据BoIFN-a基因序列(Accession number M10954 )以及酶切位点分析,在其开放阅读 框(0RF)两侧设计一对引物,由Sangon公司合成。 上游引物:5X-CCGGATCCTGCCACCTGC CTCACACC- 3',包含一个BamH I酶切位点;下游引物:5X- TCAAGCTTGTCCTTTCTCCTGAAACTCTC-3 ',包含一个 Hin d'酶切位点。
1.2.2BoIFN-a基因重组克隆质粒的构建:按常规 方法提取鲁西黄牛血液基因组DNA,进行PCR扩
增。PCR扩增体系总体积为20yL,含上下游引物各 0.5^L。反应条件 95°C 10min, 94[ 30s,69°C 30s, 72[ 1min,30 个循环,72C 10min。PCR 产物经
0.8%琼脂糖凝胶电泳回收,连接pMD18-T,构建重 组质粒pMD18-T/BoIFN-a,将重组质粒转入大肠杆菌 JM109,经氨苄青霉素(AMP)抗性、半乳糖苷酶蓝白 斑筛选,Bam HI、Hin d '双酶切鉴定以及PCR鉴 定。
1.2.3BoIFN-a序列分析:将鉴定正确的重组质粒 送Sangon公司测序,采用BLAST进行同源性比较。
1.2.4BoIFN-a基因重组表达质粒的构建:BamH
1、Hind'双酶切pMD18-T/BoIFN-a,回收目的片 段,pET32a( + )进行同样酶切,T4 DNA连接酶连接, 构建重组表达质粒pET32a( + )/BoIFN-a。将重组质 粒进行BamH I、/fcdll双酶切鉴定以及PCR鉴定。
    1.2.5BoIFN-a基因表达条件优化、SDS-PAGE分 析:将重组质粒 PET32a( + )/BoIFN-a 和 PET32a( + ) 载体分别转化BL2KDE3)感受态细胞,经氦苄青霉 素抗性筛选挑取单个阳性菌落,接种于3mL LB液体 培养基[9],37°C振荡培养,当达到0.6时加入 IPTG至终浓度lmmol/L,30°C培养4h,收集菌体,煮 沸裂解变性用于15%SDS-PAGE[U],鉴定表达产物, 同时设不加IPTG诱导的对照组。
    1.2.6纯化与复性:以QIAGEN公司提供的试剂盒 按提供的操作步骤纯化重组蛋白。详细过程如下: 取10mL菌体尚心,沉淀重悬于lmL buffer B (8mol/L urea,O.lmol/L NaH2P04> O.Olmol/L Tris-Cl,pH8.0), 室温下振摇1h,离心收集上清;600juL上清加入预先 平衡的Ni-NTA柱中,700)离心2min,收集流出液; 用 600juL buffer C ( 8mol/L urea,0. 1mol/L NaH2 PO4, 0.01mol/L Tris-Cl,pH6.3)洗涤,700g 离心 2min,收 集流出液;洗脱蛋白用200juL buffer E (8mol/L urea, 0.1mol/L NaH2P04,0.01mol/L Tris-Cl,pH4.5)700g 离心2min,收集的洗脱液即为纯化蛋白,采用15% SDS-PAGE电泳鉴定纯化结果。采用逐步降低尿素 浓度的稀释复性法进行复性。目的蛋白用Bradford 法(1976)进行定量[14],以BSA作标准,测定样品的 OD595 值。
    1.2.7抗病毒活性分析:采用细胞病变抑制法。 细胞培养板常规培养MDBK至单层后,各孔中分别 加入人a干扰素1 ] 10倍倍比稀释液和rBoIFN-a 1 ]2 倍倍比稀释液100yL,过夜培养后分别加入100 挪画自兔函姑痛廳_腳察病..寒0 r巍对 
全病变后,结晶紫显色,酶标仪测OD550值。并以人 IFN核准成国际单位。
    1.2.8抗牛轮状病毒结果:96孔细胞培养板常规 培养MDBK至单层后,每孔加入100! 2倍倍比稀 释的rBoIFN"过夜培养后用100 TCID50 BRV攻毒,
    48 h后观察细胞病变抑制结果,同时设细胞和病毒 对照。
2结果
2.1牛IFN-a基因的克隆
    以牛血液DNA为模板,PCR扩增特异性片段, PCR产物经1 %琼脂糖凝胶电泳后,在500bp处有一 条特异的DNA条带(图1),与报道的BoIFN"大小 相符。回收该片段,重组到pMD18-T载体中,酶切、
测序鉴定。
2.2序列分析
    鲁西黄牛IFN"基因测序结果以及推导的氨基 酸序列如图2所示,克隆的基因0RF为498bp (Accession number DQ396807),编码 166 个氨基酸的 成熟多肽,无糖基结合位点,与已报道的BoIFN" C 亚型核苷酸序列的同源性为98.6;,有7个碱基发 生了变异,氨基酸序列同源性为97.6%。
 
 
2.3重组表达质粒的构建与鉴定
    将所克隆的BoIFN"重组入pET32a( + ),构建 原核表达质粒 pET32a( + )/BoIFN-a,经 BamH I、 Hind$双酶切后可见在500bp处有一条特异的DNA
条带,而且PCR扩增出500bp特异条带(图3),说明 重组质粒构建正确。
2.4SDS-PAGE及纯化结果
    SDS-PAGE分析表明在30]、4h时表达量最高 而不同IPTG浓度对其表达影响不大;SDS-PAGE及
纯化结果如图4所示,IPTG诱导株与纯化产物都在40ku左右表达出了 1条特异蛋白带,与预测分子量 一致。经BandScan5.0分析,蛋白产量约占菌体总 蛋白的26.7%。经蛋白可溶性分析,所表达蛋白以 包涵体形式存在,包涵体占沉淀蛋白的30.9%。
 
2.5抗病毒活性
    纯化的重组牛干扰素能有效地抑制VSV对 MDBK细胞的致病作用,表现出较高的抗VSV病毒 活性,其活性为5 X 105u/mg。
2.6抗牛轮状病毒效果
    rBoIFN-a处理MDBK后,BRV进行感染,48h后 空白对照组细胞正常,病毒组发生了明显的病变,而 加入1:2U稀释度的rBoIFN!样品组,细胞仍未出现 明显病变。经换算rBoIFN!抗BRV病毒活性为1.5 X 105u/mg。
3讨论
    本研究从鲁西黄牛血液中扩增出了!干扰素基 因,测序结果显示该基因与已报道的BoIFN-«基因 长度完全一致,由498bp编码166个成熟多肽,含一 个ORF[3’4]。与已报道的BoIFN! C亚型相比4个氨 基酸发生了点变异,第75位Met— Thr,第86位Asp !Ala,第 97 位 Phe—Ala,第 135 位 Arg—Lys,同源性 为97.6% ’与其他几个亚型氨基酸序列同源性在 91.0% ~ 95.2%之间,与我国史喜菊等人克隆的荷 斯坦奶牛、晋南黄牛、福安水牛、富钟水牛的IFN-! 氨基酸同源性分别为92.8%、93.9%、97.2%、 96.2%[15,6]。根据国际干扰素命名委员会建议,在 一特定的干扰素型别内,有氨基酸序列或组成方面 的差异时可确定为亚型,鲁西黄牛IFN-!基因是一 种新亚型,建议命名为BoIFN-a C2,在GenBank中登 录号为DQ396807。
经软件分析,所得基因序列内部无BamH I、 Hind #酶切位点,pET32a( + )/BoIFN-a经上述两种 酶切后,不影响基因序列编码区的内部结构。原核 表达载体pET32a( + ),含T7启动子和转录终止信 号,其特点除了能够编码6个组氦酸残基外,还带有 大肠杆菌TrxA基因,TrxA基因编码109个氦基酸的 硫氧还蛋白,外源基因经多克隆位点插入后与Trx A 一起融合表达,不仅提高了表达产物的稳定性,而且 由于表达蛋白N末端含6个组氦酸,易于用亲和层 析柱纯化、鉴定。重组蛋白经尿素变性、梯度浓度尿 素和PBS分步透析复性后,在MDBK/VSV系统上测 得的活性为5 x 105u/mg,抗BRV病毒活性为1.5 x 105 u/mg,说明纯化过程不影响重组蛋白的生物学活 性,利于规模化生产。由此也表明黄牛IFN-«基因 序列的变化并没有引起抗病毒活性的改变。
在构建表达载体时,考虑到真核生物的信号肽 在原核生物中进行表达时大部分不具有分泌功能, 干扰素的信号肽蛋白可能会影响到重组干扰素的生 物学活性,本研究只克隆、表达了牛!干扰素成熟蛋 白基因,避免了信号肽对成熟蛋白的生物活性的影 响。
    干扰素有广谱抗病毒、抑制细胞增殖以及提高 免疫功能等作用。由于病毒病一直困扰着我国的养 牛业,造成巨大的经济损失,因此奶牛业生产中需要 干扰素类广谱抗病毒生物制剂来治疗和加强疫苗的 免疫效果。本研究率先在我国克隆了鲁西黄牛干扰 素基因,在大肠杆菌中成功表达了牛重组干扰素蛋 白,并对其抗病毒活性进行了分析,为重组牛干扰素 的临床应用打下了基础。
 
 
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