1. 摘要
异戊二烯芪类化合物，因其独特的生物活性，如抗炎、抗氧化、抗糖尿病、抗癌等特性，而备受关注。然而，这些化合物在自然界中的稀缺性限制了其广泛应用。为解决这一问题，研究者们探索出一种在大肠杆菌中生产异戊烯化白藜芦醇的环保生物合成方法。通过与异戊烯基转移酶共表达MVA途径，成功实现了白藜芦醇的体内异戊烯化。进一步整合白藜芦醇途径，他们构建了2-C-异戊二烯白藜芦醇的新型生物合成途径。利用代谢流工程优化乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A的积累，成功培育出高产菌株，可产生高达68.4 mg/L的2-C-异戊二烯白藜芦醇。这一研究不仅标志着异戊二烯芪类化合物的首次微生物生产，更为其可持续绿色生产奠定了坚实基础。
2. 研究内容
芪类化合物，作为一类植物多酚，展现出了抗氧化、神经保护、抗炎、抗癌、抗菌以及抗糖尿病等多方面的生物活性。其中，白藜芦醇在食品、药品及化妆品领域的应用广泛，研究也最为深入。然而，由于植物中白藜芦醇的复杂组成，使得其提取成本高昂且产量有限，这在一定程度上限制了对其潜在健康益处应用的进一步探索。因此，寻求一种绿色、高效的微生物合成方法显得尤为重要。
本研究致力于探索一种在大肠杆菌中生物合成异戊二烯化白藜芦醇的新途径。通过应用代谢工程学策略，我们研究了大肠杆菌作为潜在宿主生产异戊烯基白藜芦醇的可行性，并取得了显著的进展（如图1所示）。
大肠杆菌中通过多代谢工程策略合成2-丙烯基白藜芦醇的研究进展
- 大肠杆菌介导的白藜芦醇异戊二烯化
先前研究中，我们发现了植物内生菌
P. fici
中存在一种异戊烯基转移酶IacE，它能高效地催化白藜芦醇的2-C异戊烯化，以DMAPP为供体，转化率高达80%。为了进一步利用大肠杆菌实现这一转化，我们引入了DMAPP的合成途径。具体来说，pJBEI-6410质粒包含了甲羟戊酸途径、香叶基焦磷酸合酶GPPS以及柠檬烯合酶LS。然而，柠檬烯合酶对于GPP或DMAPP的合成并非必需，因此我们删除了柠檬烯合酶基因LS以构建pJBEI6410-1质粒。随后，从pJBEI6410-1中进一步删除香叶基二磷酸合酶基因SPPS，构建了用于补充DMAPP的pJBEI6410-2质粒。
将质粒pJBEI6410-1和IacE-pET28a(+)共同转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，并培养。当向发酵培养物中加入白藜芦醇作为底物时，仅能检测到微量的异戊烯基白藜芦醇，且未发现香叶基白藜芦醇。这一观察证实了细菌细胞内IacE的催化活性与其体外活性保持一致，且优先选择DMAPP作为异戊二烯基供体。而当使用pJBEI6410-2和IacE-pET28a(+)共同转化大肠杆菌时，异戊烯基白藜芦醇的产量显著提升。这表明，通过删除pJBEI6410-2中的GPPS基因，可以有效地促进DMAPP的积累及其后续的异戊烯基白藜芦醇生物合成。在酶促作用和体内催化下，反式和顺式2-C-异戊二烯基白藜芦醇均得以高效产生。
基于pJBEI-6410的DMAPP合成途径及其在白藜芦醇异戊烯化反应中的应用
3. 体内发酵条件的优化
为了进一步提升合成效率并缓解双质粒发酵对细胞生长的影响，研究者将异戊烯基转移酶IacE与DMAPP合成途径整合至同一质粒pJBEI6410-3中。相较于pJBEI6410-2与IacEpET28a(+)双质粒系统，使用pJBEI6410-3转化大肠杆菌BL21(DE3)后，2-C-异戊烯基白藜芦醇的产量有了显著提升。但目前从白藜芦醇到2-C-异戊二烯基白藜芦醇的转化率仍需改进。因此，研究者针对pJBEI6410-3相关培养条件进行了优化，以期达到最佳的白藜芦醇异戊二烯化转化效率。
白藜芦醇异戊烯基化合成2-C-异戊烯基白藜芦醇的工艺优化
在体内发酵条件优化的基础上，为了进一步提升2-C-异戊烯基白藜芦醇的合成效率，我们进一步对白藜芦醇异戊烯基化的工艺进行了优化。通过调整发酵温度、pH值、诱导剂浓度等关键参数，我们发现，在特定的条件下，2-C-异戊烯基白藜芦醇的产量得到了显著提升。这一优化不仅为大规模生产2-C-异戊烯基白藜芦醇提供了有力支持，同时也为其他类似合成路径的优化提供了有益的参考。
3. 对香豆酸微生物生产2-C-异戊二烯基白藜芦醇
在探索2-C-戊烯基白藜芦醇的微生物合成路径时，我们选择了以对香豆酸为起点，通过白藜芦醇途径来实现。具体来说，我们利用了拟南芥的p-香豆酰辅酶A连接酶（At4CL）和葡萄藤的二苯乙烯合酶（vvSTS），在经过密码子优化后，将它们整合到pETduet-1载体上。通过引入刚性肽接头（EAAAK）来生成融合蛋白，我们进一步比较了独立表达和融合表达这两种模式下的白藜芦醇产量。
在LB培养基中，以0.4 mM的对香豆酸为底物，我们对两种表达模式进行了比较发酵。经过36小时的孵育后，我们发现，虽然融合表达导致产量略有减少，但单独表达的白藜芦醇产量水平已经达到了0.04 mM（9.2 mg/L）。这一结果初步证明了微生物生产2-C-异戊二烯基白藜芦醇的可行性。
此外，我们还尝试了不同的IPTG诱导强度来评估2-C-异戊二烯白藜芦醇的生产能力。通过将这些关键酶共转化到BL21（DE3）细胞中，并使用适当的诱导条件，我们期待能够进一步优化白藜芦醇的产量和纯度。
白藜芦醇在大肠杆菌中的合成路径
通过将拟南芥的p-香豆酰辅酶A连接酶（At4CL）和葡萄藤的二苯乙烯合酶（vvSTS）进行融合表达，我们成功构建了白藜芦醇在大肠杆菌中的合成路径。该路径以对香豆酸为起点，经过一系列酶促反应，最终生成2-C-异戊二烯基白藜芦醇。这一路径的建立，为我们进一步探索白藜芦醇的微生物合成提供了坚实的基础。
4. 宿主细胞中2-C-异戊二烯基白藜芦醇的高效生物合成
通过共表达白藜芦醇与异戊二烯化途径，我们成功实现了对香豆酸的2-C-异戊烯基白藜芦醇的生物合成。然而，该路径的产量仍待提升，且发酵培养物中存在明显的对香豆酸和白藜芦醇积累。为了更高效地利用底物，我们决定在关键代谢节点进行战略性的代谢调节。
我们选择了与乙酰辅酶A或丙二酰辅酶A代谢相关的三个基因，并使用组成型启动子J23119进行启动子修饰。这些基因包括acs、accA和accBC，它们分别被有效组成型启动子J23119替换，以增强其表达。
通过使用pCDFRESa和pJBEI6410-3转化菌株，并评估它们对2-C-异戊二烯基白藜芦醇的生产效率，我们发现，相较于野生型BL21(DE3)，119-accA和119-accB突变株在2-C-异戊烯基白藜芦醇和白藜芦醇的产生方面表现出相似的趋势。然而，对于进行组合编辑的菌株，如119-AS、119-BS和119-ABS，其产量则出现了下降。单独编辑accA或accB基因对2-C-异戊烯基白藜芦醇的生产影响较小，但菌株119-AB中的联合编辑则导致其生产能力降低。此外，各菌株的培养基中对香豆酸残留浓度的升高也表明了底物利用率的降低。
为了进一步提升乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A的细胞内水平，我们引入了针对gltA、acpS和acpT的反义RNA（asRNA），以增强这两种关键化合物的积累。这一策略为我们进一步优化白藜芦醇的生物合成路径提供了新的方向。
相较于119-accB菌株，表达asRNA的菌株在2-C-异戊二烯白藜芦醇的产量上展现出了显著提升，最终滴度分别达到了0.23 mM 68.4 mg/L、0.18 mM 54.1 mg/L和0.16 mM 48.3 mg/L。值得注意的是，所有asRNA菌株均显示了对香豆酸利用率的增加。特别是在119-accB+asgltA培养物中，我们甚至未检测到残留的对香豆酸，而在119-accB+asacpS和119-accB+asacpT菌株中，对香豆酸的浓度也显著降低。这些结果表明，2-C-异戊二烯基白藜芦醇产量的提升以及对香豆酸的更高效消耗，均得益于乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A通量的有效重定向。有效的底物利用进一步印证了抑制乙酰辅酶A对TCA循环的消耗是有益的，这一策略不仅扩大了细胞内乙酰辅酶A库，还增强了丙二酰辅酶A和DMAPP的合成，从而进一步促进了白藜芦醇的产生及其异戊二烯化。
（此处可添加对图5的描述或分析，但原文本中并未提供具体内容，因此无法直接改写。可以保持空白或根据实际情况进行适当描述，如“图5展示了……”等。）
2-C-戊烯基白藜芦醇的生物合成代谢途径强化
本文旨在探讨2-C-戊烯基白藜芦醇的生物合成代谢途径的增强。这一研究领域对于理解该化合物的生物合成机制以及优化其生产过程具有重要意义。通过深入分析代谢途径中的关键步骤和潜在瓶颈，我们可以为提高2-C-戊烯基白藜芦醇的产量和质量提供新的思路和方法。
