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灵菌红素的发酵及提取工艺

   日期:2018-03-10     来源:百科网    浏览:3242    评论:0    
核心提示:灵菌红素的分离纯化过程是影响其质 量的关键因素,也是决定其生产成本的最主要 因素。因此,国内外研究者在灵菌红素发酵和 提取工艺方面做了大量研究工作。
  
 
众所周知,微生物发酵产品的生产除了良 好的菌种外,优良的发酵工艺也是必不可少的。 为了进一步提高灵菌红素的产量,有必要对发 酵过程进行优化和控制研究,包括培养基组分、 培养过程参数和培养模式等。同时,发酵过程 结束后,灵菌红素的分离纯化过程是影响其质 量的关键因素,也是决定其生产成本的最主要 因素。因此,国内外研究者在灵菌红素发酵和 提取工艺方面做了大量研究工作。
1. 培养基组分的优化
培养基为微生物的生长和代谢产物的合成 提供足够的营养和能量。对于灵菌红素的发酵 生产,不同菌种对培养基组分的需求也不尽相 同,研究人员常采用基于统计分析的方法设计 理想的培养基配方,以获得最大的灵菌红素产 量。例如:Su 等利用响应面法对S.marcescens 的培养基组分进行了优化,结果表明,该菌的最优培养基组分为:0.5%蔗糖、0.454%蛋白胨、 0.5%甘氨酸和1626.3 ppm KH2PO4,在最佳培 养条件下,该菌的灵菌红素产量达 2.423 g/L, 比其初始产量提高了 8.42 倍。Kim 等利用 Plackett-Burman 设计和 Box-Behnken 设计优化 了 H. chejuensis KCTC 2396 的培养基,最终使 其灵菌红素产量提高了 3 倍。
在培养基组分优化过程中,研究人员发现 某些特殊物质的添加可以增加灵菌红素的产 量。如:含脂肪酸类的物质在灵菌红素发酵生 产中发挥着重要的作用,其中作用最为明显的 是花生粉。Giri 等以花生粉培养基代替营养肉汤 培养基时,S. marcescens 产灵菌红素的水平从 0.52 g/L 迅速上升至 38.75 g/L,该产量提升的关 键因素是花生粉中含有大量的饱和脂肪酸,而 饱和脂肪酸有助于S. marcescens 合成灵菌红 素。有研究表明,脯氨酸、色氨酸和组氨酸 等含有吡咯结构的氨基酸可以作为前体物质加 入培养基中,有利于促进灵菌红素的合成。Siva 等的研究显示,脯氨酸单独或与甲硫氨酸组合 使用,可以让 S. rubidaea 的灵菌红素产量提高 数倍。此外,笔者实验室在优化 S. marcescens 发酵过程时发现当发酵培养基中添加 0.1 g/L 的 二甲基亚砜时,灵菌红素的产量可以提高近 1 倍,分析其原因可能是二甲基亚砜增加了细胞 膜的通透性,使其从细胞内分泌至细胞外,减 少了灵菌红素在细胞内积累,从而解除了反馈 调节,提高了灵菌红素的产量。
为了进一步降低生产成本,有效利用各类 资源,研究人员还不断致力于寻找更廉价高效 的培养基。de Araujo 等考察了木薯废水和玉米 浸出液对 S. marcescens UCP 1549 产灵菌红素的 影响,结果发现利用 6%木薯废水和 2%甘露醇为培养基时,该菌的灵菌红素产量可达 49.5 g/L, 这是目前文献报道中灵菌红素的最高产量。Sumathi 等从以制革厂产生的废肉为食的鱼类 肠道中筛选到 1株 S. marcescens,该菌可以在制 革废肉培养基中生长并合成灵菌红素,在最佳培 养条件下,其灵菌红素的产量可达约48g/L。笔者实验室也探索了利用硫酸软骨素生产过程中 产生的废蛋白代替蛋白胨来培养 S. marcescens, 在适当浓度下有利于灵菌红素产量的提高 (结 果待发表)。由此可以看出,利用工农业废弃物 作为培养基原料发酵生产灵菌红素是有效降低 成本、合理利用资源的理想途径。
2.发酵参数与发酵模式的优化
发酵参数 (如温度、pH 等) 对微生物合成灵 菌红素有着重要的影响,其中温度对沙雷氏菌属产 灵菌红素的影响最为显著。该菌属产灵菌红素的过 程属于温度敏感型,当温度低于 30 ℃时,其产灵 菌红素的能力较强,温度高于 37 ℃,其基本不产 色素。多数研究表明,S. marcescens 产灵菌红素的 最佳温度为 28 ℃。为了探究温度对灵菌红 素合成的影响机理,徐虹等分析了 S. marcescens JNB5-1 在不同温度下的蛋白表达差异,结果发 现在高温 (37 ℃)培养下,参与灵菌红素合成的 相关蛋白 (酶) 表达量显著下降,从而降低了灵 菌红素的产量。还有研究指出,S. marcescens TKU011 PG 的最适生长温度和最适产色素温度 有一定差别,作者将菌体生长温度设为 30 ℃, 灵菌红素合成温度设为 25 ℃,其灵菌红素产量 比恒定 30 ℃条件下有明显提高。该研究还考 察了溶氧对灵菌红素发酵的影响,当采用含挡板 的锥形瓶代替普通锥形瓶进行发酵时,灵菌红素 的产量从 0.84 g/L 提高至 2.48 g/L,由此可以 看出,在其他条件确定的情况下,适当提高溶氧可以增加灵菌红素的产量。因此对氧传递的 进一步研究对灵菌红素的发酵具有促进作用, 特别是在发酵规模放大过程中对溶氧的控制具 有指导意义。
液体分批培养是微生物发酵最常用的培养策 略之一,也是实验室发酵灵菌红素所采用的基本培 养模式。但是,灵菌红素的生产也可采用固体发酵 的模式,如:Miao 等比较了 Serratia proteamacula 657 的液体培养和固体培养过程,发现两者的灵菌 红素产量分别为 0.07 g/L 和 0.18 g/L。此外,在 微生物次级代谢产物生产过程中,分批补料发酵 策略也常用于提高产物的产量。Tao 等将该策略 应用于灵菌红素的发酵,使菌体的生长和色素的 合成分成两个阶段:第一阶段,以葡萄糖为主要 碳源,有利于细胞的生长;第二阶段,通过补料 的方式向培养基中添加甘油,促进灵菌红素的合 成。在该策略的作用下,灵菌红素的产量比初始 产量提高了 7.8 倍。另外还有一些不同的细胞 培养模式用于灵菌红素的发酵,例如:固定化细 胞培养等。Chen 等首先将 S. marcescens C3 在液 体培养基中培养至 OD600=10,离心收集菌体后包 埋于海藻酸钙凝胶小球中继续发酵,最终色素的 产量比对照组提高了近 2 倍,达15.6g/L。Bae 等开发了一套新的一体式生物反应器,该反应器 不仅提高了灵菌红素的产量,而且还简化了色素 的分离步骤。其主要特点是:反应器内部包含 1 个由不锈钢滤网制成的平台,平台内填充聚合树 脂用于吸附发酵过程中产生的色素,结果该反应 器中灵菌红素的产量达 13.1 g/L,比普通反应器提 高了 2.6 倍。
3. 灵菌红素的分离纯化
在微生物发酵过程中灵菌红素主要存在于细胞内,特别是附着在细胞膜上,因此需要经 过一系列的分离纯化过程才能得到高质量的产 品。目前,灵菌红素的分离方法主要包括有机 溶剂提取法和树脂吸附法。有机溶剂提取法常 用的试剂包括甲醇、丙酮、乙酸乙酯和氯仿等。 Chen 等将发酵液与甲醇混合振荡,离心收集上 清,浓缩后经氯仿萃取得到灵菌红素粗品。如 此直接抽提发酵液会使液体的处理量增大, Juang 等开发了一种以截留分子量为 1 kDa 的再 生纤维素膜为材料,对甲醇抽提液进行超滤浓缩 的方法,该方法可以使抽提液浓缩 4 倍,回收率 为 81%。为了减少液体处理量,也可将发酵液 离心后直接从细胞中抽提灵菌红素。笔者实验室 对利用超声辅助提取 S. marcescens jx1细胞中灵 菌红素的条件进行了研究,结果发现以酸性丙酮 为溶剂 (用量为 27.2 mL/g 细胞),在23.4 ℃条 件下提取 17.5 min 可以获得最好的提取效果。
树脂吸附法主要利用树脂对灵菌红素的物 理吸附作用,从发酵液中分离灵菌红素。但灵 菌红素的水溶性差,在树脂吸附过程中仍需有 机溶剂或表面活性剂的参与。Juang 等利用明矾 和甲醇对 S. marcescens SMDR 的发酵液进行预 处理,去除菌体后的清液用大孔树脂 HP-20 进 行吸附,最后用含 90%甲醇和 10% 0.2 mol/L HCl 的混合液进行洗脱得到灵菌红素样品,该研 究还发现树脂 HP-20 对灵菌红素的吸附过程是 自发的放热过程 (∆H=–1.78 kJ/mol),仅受疏水 作用的影响。Wang 等利用树脂 X-5 建立了灵 菌红素发酵与分离相耦联的系统,该系统主要由 发酵罐、泵和吸附柱组成,当发酵进行 20 h 后, 发酵液经泵在吸附柱和发酵罐间循环,直至发酵 结束,从吸附柱上洗脱得到灵菌红素,该耦联系 统不仅免去了细胞分离的步骤,而且直接获得一定纯度的灵菌红素,该过程的总收率达 83%。
 
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