为您总结了一个非常经典且经过优化的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）高密度发酵基础配方，主要用于重组蛋白的分泌表达。以下是基于您提供的配方整理的详细配制指南、关键步骤说明和注意事项。
配方总览（1L培养基）
A.基础盐溶液与氮源
组分 用量 备注
K₂HPO₄ 6.6 g 提供磷和钾，作为缓冲对的一部分
KH₂PO₄ 3.8 g 与K₂HPO₄组成磷酸盐缓冲系统，稳定pH
(NH₄)₂SO₄ 3.5 g 主要无机氮源
柠檬酸钠 1.0 g 络合剂，可能辅助调节金属离子和代谢流
MgSO₄·7H₂O 1.0 g 镁源，参与能量代谢和酶功能
蛋白胨 6.0 g 提供多肽、氨基酸等快速利用的有机氮源
B. 微量元素溶液（1000×储存液）
· 配制方法：将以下组分依次溶于约800 mL 稀酸（如0.1 M HCl） 中，定容至1 L，4℃避光保存。
· 配方：
· FeSO₄·7H₂O: 50 g (对应终浓度 50 mg/L)
· MnSO₄·H₂O: 10 g (对应终浓度 10 mg/L)
· ZnSO₄·7H₂O: 10 g (对应终浓度 10 mg/L)
· CaCl₂: 5 g (对应终浓度 5 mg/L)
· CoCl₂·6H₂O: 1 g (对应终浓度 1 mg/L)
· CuCl₂·2H₂O: 1 g (对应终浓度 1 mg/L)
· 使用：按 1:1000 稀释加入基础培养基，即每1L培养基加 1 mL 此储存液。
C. 碳源（单独灭菌）
· 葡萄糖：20 g
· 必须单独配制并灭菌（如115℃, 15分钟或过滤除菌），在灭菌后、接种前加入已灭菌的基础培养基中，以防止美拉德反应产生抑制物。
配制与灭菌步骤
1. 配制基础液：
· 用去离子水溶解A部分的所有组分（除葡萄糖外）。
· 加入1 mL 上述配制的微量元素储存液（B部分）。
· 用 NaOH 或 KOH 溶液调节pH至 7.0 - 7.2。
· 定容至约 980 mL（为后续加入葡萄糖液预留体积）。
2. 灭菌：
· 将配制好的基础培养基分装到合适的发酵罐或摇瓶中。
· 121℃, 高压蒸汽灭菌20分钟。
3. 加入碳源：
· 葡萄糖（20g）可溶于约20 mL去离子水中，单独灭菌（115℃, 15分钟或0.22 μm滤膜过滤除菌）。
· 待基础培养基冷却至室温或所需培养温度后，在无菌操作下将灭菌的葡萄糖溶液加入。
4. 补料（高密度发酵关键步骤）：
· 上述配方为批式培养基，20 g/L的葡萄糖不足以支撑高密度生长（OD₆₀₀通常可达到15-30）。
· 要实现更高密度（OD₆₀₀ > 50），必须在发酵中后期进行补料。通常补加浓缩的葡萄糖溶液（如500 g/L）和氮源（如酵母粉、蛋白胨或硫酸铵溶液）。
· 补料速率需根据溶氧（DO）变化、残糖浓度或生长曲线进行反馈控制。
发酵过程控制要点
1. pH控制：
· 如您所述，发酵过程中通常使用 氨水（如12.5%-25% NH₄OH） 自动流加来控制pH在7.0左右。
· 优势：氨水既能中和发酵产生的酸，又能作为额外的氮源，促进菌体生长。
· 监控：设置pH电极，连接自动控制器，设定pH在6.9-7.1之间。
2. 溶氧（DO）控制：
· 高密度培养耗氧极快，必须保证充足的供氧。
· 通过提高搅拌转速、增加通气量（通常为1-2 vvm）或通入纯氧来维持DO在20%-30%饱和度以上，防止缺氧。
3. 诱导（如果表达重组蛋白）：
· 如果使用诱导型启动子（如Pxyl, Pspac），需在适当生长期（通常OD₆₀₀在5-10之间）加入诱导剂（如木糖、IPTG）。
· 诱导时机和剂量需要优化。
4. 取样与分析：
· 定期取样，监测OD₆₀₀（菌体密度）、pH、残糖浓度。
· 离心样品，取上清进行SDS-PAGE或活性检测，分析目标蛋白的表达量和分泌情况。
注意事项
1. 微量元素溶液：必须用稀酸配制并按要求稀释，直接加入高浓度储存液可能导致金属离子沉淀。
2. 葡萄糖灭菌：切记分开灭菌，避免与含氮物质共热产生褐色抑制物。
3. 泡沫控制：高密度发酵易产生泡沫，可添加少量消泡剂（如聚二甲基硅氧烷），但需评估对目标蛋白的影响。
4. 种子液质量：使用生长旺盛、处于对数期中后期的种子液（OD₆₀₀ 2-5，无污染），接种量一般为1%-5%。
这个配方是一个优秀的起点，具体的补料策略、诱导条件和过程参数（温度、pH设定点）需要根据您使用的具体枯草芽孢杆菌工程菌株和表达的目标蛋白进行微调优化
