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利用酶动力学拟合在密闭条件下香菇呼吸速率方程及米氏方程

   日期:2011-01-12     来源:发酵工业网    作者:发酵网    浏览:1623    评论:0    
  
本研究对香菇在273K、283K和293K条件下密闭容器中的氧气和二氧化碳随时间浓度变化进行了测定,通过酶动力学原理和利用非线性估计法、多重回归分析分别获得气体成分的变化率曲线和米式方程,从而获得相应参数,求得反映呼吸状态的呼吸熵动态变化规律以及温度影响参数—活化能,这样就可以求出在任意温度、有氧呼吸气体环境条件下果蔬的最大呼吸速率,为气调包装系统设计提供必要依据。
关键词:酶动力学原理 非线性估计法 多重回归法 米氏方程 呼吸熵 活化能

香菇Lentinas edodes (Berk)sing,又叫香菌、冬菇,属白蘑(口蘑)科香菇属,为食用菌类蔬菜,在蔬菜中属于呼吸强度较大的一类品种。植物活体的呼吸总方程式为:

植物体贮藏环境中氧气以及二氧化碳含量直接影响到植物体的新陈代谢,呼吸速度越快消耗体内的糖分等物质就越多,鲜度下降就越快。植物的有氧呼吸涵盖了一系列的酶催化反应,其中包括葡萄糖酵解到丙酮然后通过三羧酸(TCA)循环获得产物CO2[1]。因此,有效的气调包装能抑制香菇的呼吸速率及新陈代谢作用,延缓衰老达到保鲜的效果。呼吸强度是设计气调包装方案的重要指标参数,影响呼吸强度的因素有许多,如温度、湿度、二氧化碳浓度、氧气浓度和时间等。这些参数将为包装膜透气率的计算和选择提供理论基础。本研究延承了Lee et al.(1991)[2]的三维参数模型—时间(t)、氧气浓度(O2%)和二氧化碳浓度(CO2%)浓度之间的相互关系,建立酶动力学方程即Michaelis-Menten方程,同时考虑三种参数影响,得到香菇呼吸模型,为气调包装参数的选择提供理论基础[3]。

1 材料与方法

1.1 材料

香菇采购于上海杨浦区渭南路农贸市场,选取菇型圆整、菇柄正中、不开伞,卷边整齐,无病斑的香菇为实验材料,并进行清洗、沥干处理,实验前将香菇在预设的三种温度(293K、283K和273K)下贮藏5个小时直至达到实验所需温度。

1.2 仪器

103层析仪[色谱柱为:Porapak-Q柱(60~80目)+13X(60~80目):上海仪器厂

1.3 主要实验方法

1.3.1 密闭实验设置 实验通过初始条件即O2:21%;CO2:0.0%,将一定质量的香菇放于一定体积的玻璃容器中,瓶底装入干燥剂(一定量的硅胶和CaCl2(s))以控制体系湿度,因为湿度会影响到贮藏样品的水分活度,水分活度的大小直接影响到生物体代谢快慢,这就会对体系氧气和二氧化碳的浓度变化有较大影响[4]。其次,将瓶口用橡皮塞和真空封泥密封后(橡皮塞上有一φ8mm的小孔,用φ15mm×5的硅胶垫密封),置于一定的水浴或冰浴中待温度恒定,然后每隔0.5-1.0小时用注射器量取0.5mL气体成分注入层析仪进行检测,平行检测两次,同时记录下O2、CO2对应检测的峰高,计算出对应体系中的百分含量。

层析仪中参数设置为载气:99.995%N2;流速15mL/min;柱温:40℃;检测器:TCD,温度:80℃;进样温度:40℃;定量方法:外标法。每组实验的设置见表1:

表1 香菇呼吸密闭体系环境设置
Table 1 The design of closed system method of three different temperatures
温度(K) 273 283 293
香菇质量(g) 180.9 295 281.6
容器体积(L) 1 2 2
空隙体(L) 1.22 0.89 0.75
处理条件 冰浴 恒温水浴 恒温水浴

1.3.2 密闭容器中的呼吸速率方程的拟定 由于各类蔬菜的品种和个体差异较大,呼吸环境中氧气、二氧化碳浓度随时间的变化也千差万别,所以历来文献都没有参照统一的方程来描述气体浓度随时间的变化。依据米氏方程的Lineveaver-burk曲线图可知呼吸化学方程在初始阶段反应速度维持恒定即呈线性,但随着时间的增长,曲线的斜率变化速度减少,反应速度趋向一恒定值,因此,

简单的直线方程并不能真正地表达浓度与时间的关系,气体浓度随时间变化的曲线呈弧线形,并无限趋近一定值,将所有的参变量(rO2,rCO2)和应变量([O2],[CO2])同时表示成时间(t)的函数,通过上述推论以及结合STATISTICS软件中的非线形估计法[5](Nonlinear Estimation),选取损失函数(L)值最小(损失函数(L)=(观察值(OBS)-预测值(PRED))2 ),复相关系数(Multiple R)接近于1的公式作为反映不同温度下香菇在密闭容器中气体浓度与时间的关系式:

[1]

[2]

其中,氧气和二氧化碳的浓度([O2],[CO2])以百分数%表示,时间t以小时(hr)计算。因此,根据式[1]、[2]可以得出d[O2]/dt以及d[CO2]/dt:

[3]

[4]

则呼吸速率为:

[5]

[6]

式中,r—呼吸速率(氧气的消耗率或二氧化碳的产生率)(mg/kg﹒hr);

MO2/CO2—氧气或二氧化碳的摩尔质量(g/mol);

V—空隙体积,L;

W—密闭体系中香菇的重量,g;

P—体系压强(Pa);

R—理想气体常数(8.314J/mol﹒K);

T—开氏温度(K)。

1.3.3 Michaelis-Menten方程的确立 依据酶动力学呼吸模型[4]要求体系保持有氧呼吸状态即[O2]>1.5%或[CO2]<20%才是有效的[6],氧气过低或二氧化碳过高将导致香菇无氧呼吸,则不符合米氏规律。在本次实验中同时测定了单位时间内底物(氧气)的消耗量以及产物(二氧化碳)的生成量。其中二氧化碳又是化学反应的非竞争性抑制剂,因此,依据米氏方程的非竞争性作用的速度方程为如下公式:

[7]

[8]

式中,Vm、Km和Ki—调整因子;

Vmi—最大反应速率(氧气消耗的最大速率或二氧化碳产生的最大速率)(mg/kg﹒hr);

Kmi—表观米氏常数(%);

Ki—抑制系数(%)。

通过实验所测结果利用STATISTICA软件进行多重线性回归分析求得其值。而rCO2/rO2的值就是呼吸熵(RQ)[7],它是表现氧气与二氧化碳共同作用下香菇呼吸状态的动态因子,也是定性代谢途径以及表征脱羧酶或氧合酶系统的一个有效参数。本次实验中要求体系维持在有氧呼吸状态,所以通过计算,RQ应该小于或接近于1,即rCO2≤rO2。

1.3.4 温度对香菇呼吸作用的影响 氧气和二氧化碳的变化率除了受浓度、酶等因素的影响,最关键的是受到温度的影响,在求得了不同温度下氧气和二氧化碳的最大变化率(Vm)后,通过Arrhenius[8]关系将1/T与LnVm进行线性回归,其斜率值为Ea/R,Ea(kJ/mol)就是活化能,由此可推算其他温度下香菇呼吸作用的最大呼吸速率,其预测方程为:

[9]

式中,Vm0—已知的氧气最大消耗率或二氧化碳的最大产出率(mg/kg﹒hr);

T0—已知的温度(K);

Vm—T温度下的氧气最大消耗率或二氧化碳的最大产出率(mg/kg﹒hr)。

2 结果与分析

2.1 不同温度下香菇在密闭体系中气体浓度函数的确定

各个温度下的氧气和二氧化碳随时间的变化的回归方程见表2。

由表2可以看出由实验数据拟合出的曲线有较好的吻合性,从而得出各个温度下以时间为自变量,氧气与二氧化碳浓度为应变量的方程式。

表2 氧气、二氧化碳浓度随时间变化的非线性回归方程
Table 2 Nonlinear estimation regression of O2,CO2 change with time
温度K 非线性回归估计方程 损失函数(Loss) 复相关系数(Multiple R)
293 9.77 0.993
3.56 0.988
283 9.60 0.987
6.37 0.993
273 10.89 0.987
5.21 0.963

2.2 Michaelis-Menten方程及各参数的确立

在求得了各个温度下氧气和二氧化碳浓度与时间的拟合方程后,就可以根据公式[5]~[8],求得氧气的呼吸消耗速率rO2和二氧化碳的呼吸生成速率rCO2,拟合曲线见图1;根据公式[7]、[8]通过多重线性回归分析,获得表3结果:

表3 香菇在273K、283K和293K下根据多重回归求得米氏方程各参数值
Table 3 Estimated values for Michealis-Menten model of shiitake in 273K,283K and 293K determined by multiple linear regression
温度
K
Km
%O2
Vmax
mg/kg·hr
Ki
%CO2
R2 标准误差
(Std.Error)
293 0.27 981 1.33 0.985 0.0059
0.23 828 1.58 0.985 0.000034
283 0.4 743 2.86 0.989 0.060
0.14 314 8.20 0.989 0.000038
273 0.05 117 8.11 0.973 0.22
0.017 57.4 23.58 0.973 0.00015

注:2、4、6行数据由公式[7]求得,3、5、7行由公式[8]求得。

表3中,每组方程各项的标准回归化系数(BETA)在软件中显示高亮度(即P-level<0.05)说明线性显著。


图 1 O2、CO2浓度对香菇呼吸速度的影响
Fig.1 Effects of O2,CO2 concentration on respiratory rate of shiitake

由图1可以看出在293K条件下,香菇的由始至终呼吸熵在0.86~1.02之间变化,其中,当氧气浓度在1.0%和二氧化碳浓度在13.4%条件下呼吸熵约为1;在283K条件下,香菇的呼吸熵在0.4~1.6之间变化,当氧气浓度为5.2%和二氧化碳浓度为7.2%,RQ约为1;273K条件下RQ区间为0.4~1.03,当氧气浓度为0.7%和二氧化碳浓度为8.4%,RQ约为1。由此表明本实验是在有氧呼吸的条件下进行的,计算有效。

2.3 温度对香菇呼吸作用的影响

三个温度下LnVm的值统计见表4:

表 4 不同1/T下,LnVm 的值
Table 4 The values of LnVm in different 1/T
1/温度(K) 1/273 1/283 1/293
LnVm1 4.76 6.61 6.89
LnVm2 4.05 5.75 6.72

不同1/T下,LnVm线性回归预测值与观察值关系中氧气斜率=-0.93,复相关系数=0.927;二氧化碳斜率=0.99,复相关系数=0.990。

通过计算求得的在氧气最大消耗率活化能为7.73kJ/mol;二氧化碳最大产生率的活化能为8.23kJ/mol。根据公式[9],在已知一定温度下氧气的最大消耗速率或二氧化碳的最大产出率,就可以求得其他温度条件下的最大变化率。例如:在有氧呼吸条件下,已知香菇在273K下氧气的最大消耗率为117mg/kg·hr,根据公式[9]代入相关参数值可求得在288K下氧气最大消耗率为139.7 mg/kg·hr。

3 结果与讨论

本次实验利用米氏方程机理,选取了具有一定特征的函数形式,拟合了一定温度下氧气、二氧化碳浓度随时间变化的方程,并且复相关系数都达到了0.95以上。

米氏方程的各个参数值为进一步气调包装的参数设定提供理论依据,并且方程原始模型仍为时间的函数,大大简化了由于呼吸作用而导致体系的复杂性。实验中同时也获得了对呼吸熵的动态变化。

温度因子对香菇呼吸作用的影响则通过Arrhenius关系求得Ea,同时求得在有氧条件下不同温度下的氧气的最大消耗率或二氧化碳的最大产出率,为以后在不同温度下进行气调包装提供数值参考。

 
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