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利用微生物菌体开发蛋白饲料资源(3)

   日期:2011-01-12     来源:发酵工业网    作者:发酵网    浏览:1220    评论:0    
  
3、利用微生物菌体生产SCP有关问题
3.1 条件
为使利用微生物生产SCP实用化,必须满足以下条件:

3.1.1 原料廉价,并且充足而易于收集。

3.1.2生长速度和生长效率高,菌体收率高。

3.1.3易培养,最好是较为粗放,可连续生产。

3.1.4菌体容易收集,即下游分离工艺简单。

3.1.5废水问题少,不产生二次污染。

3.1.6 产品蛋白质含量高,氨基酸组成合理,生物活性物质含量多等。

3.1.7 符合国情和市场需求。

3.1.8 无病原性和毒性。

关于原料的问题,我们在前面已经进行了系统的阐述,其它问题则基本上为技术处理上的问题,我们分别进行阐述和论述。

3.2 生产效率
生产效率是指单位时间内,单位容积中的菌体产量,对于固态发酵而言,则是指单位时间内的单位菌体转化率。
dx/dt=ux 式中:dx/dt-----生长速度 (kg/m3.h)

u-----比生长速率 (/h) x----某一时刻的菌体浓度 (kg/m3)

一般说来,细菌的比生长速率较大,酵母次之,霉菌最小,但霉菌也有比生长速率较大的。酵母菌的生长速度随着原料的不同,而在2---4kg/m3.h变动,氢细菌生长速度为3.14kg/m3.h,而植物有机物生产效率最高的热带雨林和甘蔗的生长速度是500kg/m3.年左右,在热带地区培养光合成藻类的生长速度也大至与此相同,可见与此相比,微生物的生产效率可谓巨大,且不受季节,气候和地区所限制,可实现工业化生产。

在固体发酵中,基料是固态,不流动,物质交换少,细胞与基料的接触面少,沟通也少,故而会防碍生长效率的提高,(它仅靠菌丝的蔓廷生长),所以较高的接种量是必需的,可增加微生物细胞的发源点,大大缩短发酵周期,如酵母菌的接种量要达到1%,霉菌孢子的接种量也至少0.1%(而若是液体发酵则只需要0 .01%)。

3.3 菌体收率

固体发酵中的菌体转化率可以从产品检测到的每克干物质所含的细胞数,再通过计算而得,计算公式如下;

固态发酵菌体转化率(%)=(A/116 + B/650)× D × 100% kg/kg

式中:A----镜检中的大酵母细胞(如常用于固态发酵的扣囊拟内孢霉或皮状丝孢酵母)亿个/克

B----镜检中的小酵母细胞(如常用的辅助菌种掷孢酵母,红发夫酵母,铁红酵母,产朊假丝酵母,解脂酵母,红酵母等)亿个/克。

D-----一种系数,在发酵后期,有很多细胞发生自溶,或引进自溶工艺以提高产品营养价值等,这样就使检测到的表观细胞数信偏低,根据笔者多年的试验结果,D值在1.2---1.9之间,尤其对于使用了曲霉菌的固态发酵来说,由于其菌丝无法计数,故而D值往往在1.5以上。

116-----为扣囊拟内孢霉酵母菌每克纯细胞中的细胞数,亿个/克。

650----为辅助酵母菌每克纯酵母中的细胞数,亿个/克。

对于固态发酵来说,菌体转化率即为成品中,菌体占产品总量的百分比。一般在10—40%之间,转化率越高,产品得率就越少,这是因为在转化过程中,消耗了基料中的碳水化合物作为能源,一部分碳源变成二氧化碳挥发掉了,而产品是菌体与培养基残基的总和。当然,转化率越高,产品的生物活性也越高,营养价值越丰富,粗蛋白含量也越高。

上述公式是事后检验方法,可用来试验哪些原料的碳源适合于用来固态发酵。

菌体产量的预期值,则一般按与碳源基质完全氧化所得的能量ATP的摩尔数成正比的方法估算。通过多次试验得知,以1kg的葡萄糖为碳源基质预期的菌体产量是0.5kg,而由1mol的葡萄糖完全氧化可生成38mol的ATP(前提条件是充分供氧及其它元素营养条件具备的情况下)。根据这一前提,若能推断出从1mol其它基质生成的ATP的摩尔数的话,即可以计算出该基质的菌体产量预期值,(见表8)

表8:由不同的碳源获得ATP的产量及菌体预期收率

基质

ATP产量

菌体产量(g/g)

Mol/mol

化为g/g

葡萄糖

正十二烷

乙醇

乙酸

甲醇(细菌)

甲醇(酵母)

甲烷

氢(细菌)

38

99

17

11

9

6

6

2—3

0.21

0.582

0.37

0.18

0.28

0.19

0.37

1.0—1.5

0.5

1.385

0.88

0.43

0.67

0.45

0.88

2.37—3.55

例如:正烷烃完全氧化,由1mol正十二烷烃可生成99molATP,则菌体产量预期值应为1.385kg/kg。

所以在发酵过程中,碳源的主要作用是提供能量,部分作为菌体的细胞碳骨架,其它物质(如氨基酸,维生素,无机盐等)则主要用来合成RNA,DNA,蛋白质,酶,脂质,多糖,激素等,进而进一步构成核糖体,线粒体,细胞膜------等细胞器,再进一步合成细胞。而能量则来自于碳源的氧化磷酸化(好氧时),或基质水平磷酸化(缺氧时),碳源在好氧时主要变成二氧化碳,而在厌氧时主要生成乳酸、乙醇、醋酸等。一般来讲,好氧固态发酵物质消耗大,也即这个原因,但菌体转化率比厌氧时要高得多,实践中要根据不同的应用目的,来选择不同的发酵方式。

国内固态发酵生产SCP大多为高蛋白基料水平上的固态发酵,基质中作为能源物质的碳水化合物较少,发酵一定时间后,微生物便会分解基质中的蛋白质和氨基酸,以利用其中的碳骨架作为能源,同时脱氢产生刺鼻的氨气,这是十分不经济的,也是失败的。故而必须严格控制发酵时间,使之在30小时之内结束发酵,或适当提高基料中的碳水化合物含量。发酵目的应以适度水解基料中蛋白质,以提高其消化率,并产生生物活性物质为主,而追求高的菌体转化率是不现实的。

3.4 生产上的问题
对于液体深层发酵来讲,机械化程度较高,操作简单,技术也很成熟,生产上一般没有问题,当然其最大的壁垒是投资巨大。
对于固态发酵来讲,则存在以下问题:
3.4.1 单位面积产量小。即占地面积大,而料厚又受到限制,太厚则通风散热均成问题。

3.4.2 传质问题:经常出现的情况是,在实验室不成问题的通风散热,菌丝扩大问题,一到大生产中,却往往造成烧料,产氨味等传质问题,尽管加装了搅拌设备也往往防不胜防。
最直接的解决方法是,用大接种量,增加发菌点,然后控制在20小时之内结束发酵,即在问题尚未出现之前就结束发酵。

3.4.3 检测问题:在液体深层发酵法中,可以用电子计算机进行控制培养。但在固态发酵中,关于PH值、温度、基质含水量、菌体增殖量等在培养过程中的变化检测,几乎是不可能的。
我们常常见到这样的情况:插入料中的温度计显示是35度,但实际上已经超过了40度,因为风机一开,温度值马上上升到了40度以上,这就是因为传质不均的结果。

3.4.4 劳动强度大,如何在固态发酵中引进自动化的设施将是今后要研究的课题。

3.4.5 当然固态发酵也具有液体深层发酵所没有的优势。只要选择好适应的菌种,固体发酵具有无比的发展潜力,尤其是在高附加值产品的开发上,许多单位已能用固态发酵生产微生态制剂、植酸酶、复合酶等,而且几乎只需投入几万元资金便可生产经营。

另外,在工艺上固态发酵需要的供氧量相对要少得多,这是因为固体微粒之间的空隙较多,固体比面积大,与固体微粒接触的空气多等。但必须及时排除空隙中的二氧化碳和热量,通过鼓风补充新鲜的空气。总的来说,固态发酵的成本、能耗要小得多。

3.5 微生物菌体蛋白SCP的安全问题。
在考虑微生物菌体蛋白时,安全性是至关重要的。致癌性芳香化合物(石化产品中)、重金属、真菌毒素、病原性菌、感染性、遗传性等。均应经过长期而充分的考虑。联合国蛋白质咨询小组PAG鉴于这一问题的重要性,提出了有关指导原则,对开发SCP方针提出了建议。

在欧洲以国立机构为中心的对微生物蛋白质的毒性进行了详细的试验,并已转向实用化。在日本,1970年12月厚生省食品卫生调查会石油酵母特别部会发表了36条22款的安全性标准。我国对SCP未作特别的检验标准,只是在需要时对技术进行鉴定时,才做“三致实验”,但对食用蛋白新产品,却有着严格的标准。

通过动物试验,现已确认,在微生物蛋白中含有较多的核酸、嘌呤碱基、正烷烃酵母中含有奇数碳原子的脂肪酸及残留的烷烃等,在生理学和病理学方面均无问题。

对于固态发酵生产的蛋白饲料来说,产品经小试出来,应做以下的毒性毒理实验,方可上市:
3.5.1 产品的急性和非急性毒性试验。
3.5.2 微核试验。
3.5.3 Ames试验。
3.5.4 Sce试验。
3.5.5 黄曲霉毒性化验(黄曲霉毒素B1小于5ppm)
3.5.6 产品用Oxoid CM145葡萄球菌110号培养基测定致病性葡萄球菌;用Oxoid CM133/164去氧胆酸钠琼脂测大肠杆菌;用Oxoid CM329改良煌绿琼脂测沙门氏菌;用焦性没食子酸氢氧化钠培养法测定厌氧菌。
3.5.7 有毒微量元素测定。
3.5.8 薄层分析法分析杂色曲霉素,3、4-苯并芘,亚硝胺,比色法分析曲酸。

在确认各项指标安全后,进行动物喂养试验,以进行胴体解剖,饲料报酬,日增重,抗病性,蛋白消化率,代谢能,消化能等测定。

4固体发酵特点与固体发酵微生物
固态发酵饲料在我国饲料工业中占据了一定的比重。年规模已经达到几十万吨以上,而正如前所述,仅利用我国食品与发酵行业的废渣糟,可产生蛋白饲料近1000万吨,再加上可资利用的各种农副产品及下脚料,可利用资源非常丰富。加上近年来该行业的发展,已积累了丰富的技术与经营经验,故而发展潜力巨大,有可能成为我国饲料与环保工业中的一支新军。

4.1 固态发酵的微生物生理特点。
在自然界中,微生物生长除了必须有营养物质供应外,还必须具备相应的物理化学环境,例如这些营养物质还必须有与微生物细胞内渗透压相平衡的物理化学状态,才能使微生物开始增殖。例如在液体培养中,在含有高浓度的食盐(或蔗糖)的培养基中,由于细胞外部的高渗透压,引起质壁分离,随着细胞内物质的向外泄漏,微生物便会死亡或受到抑制,盐渍罐头和糖水罐头不易变质,便是这个道理。根据同样的原理,在固体基质的表面,并不是所有的微生物都能生长,因为固态发酵水分少,微粒表面的营养物和营养盐浓度是很高的,只有那些具有一定的耐高渗透压性能的微生物才能正常生长,例如霉菌、酵母、及放线菌中的一些菌株。
一般来说,霉菌和扣囊拟内孢霉酵母,皮状丝孢酵母等可以在含有适度水分的固体基质表面生长良好,但许多细菌却由于细胞内渗透压没有霉菌那么高,而仅能在含有适度营养物质的液体中生长,(部分耐高渗的球菌除外)。事实上,固体发酵也大多是用霉菌和酵母来发酵的。
固态发酵即是耐高渗透压环境中的发酵,一些典型的例子是制酒行业中的制曲,酱油行业中的制曲,以及豆豉,酵母饲料等。目的分别以获得高量的淀粉酶活性、蛋白酶活性、酵母细胞数及丰富的生物活性物质为主。霉菌和酵母等能在比较干涸的基质表面生长,而细菌等杂菌的污染度很小,固体培养就是这样一种巧妙的培养方法。

 
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