为了克服以上问题，研究人员开发了一种HMB的从头生物合成途径，并且优化了重组质粒的遗传结构，筛选鉴定HMB生物合成途径中高效的关键酶，发酵生产HMB的产量可达到17.7 g/L。并且该菌株还能够以其他可再生碳源如木糖、甘油和乙酸来生产HMB，为HMB制备提供了一种绿色可持续的生产方式。
大肠杆菌中HMB从头生物合成途径的构建
为了利用大肠杆菌合成HMB，作者构建了含有atoB（巯基酮酶）、mvaS（HMG-CoA 合成酶）、aibAB（3-甲基戊二酰辅酶A脱羧酶）、liuC（3-MG-CoA 水合酶）和tesB（硫酯酶）基因的工程菌株，各酶的功能如图所示（图1B）。
作者将菌株在M9培养基中发酵培养，可生成660mg/L的HMB（图2A），并且对细胞生长没有毒性。接着作者探究了HMB合成途径中单个基因对HMB生产的影响，发现不含有tesB酶的菌株仍然可以生成 310 mg/L的HMB，说明过表达硫酯酶有助于HMB- coa更快地转化生成HMB。
更有效的大肠杆菌天然硫酯酶的鉴定
根据上述结果，作者利用ASKA文库筛选鉴定了除tesB外其他的大肠杆菌内源性硫酯酶/水解酶/辅酶a转移酶（图3A），结果发现硫酯酶YciA和MenI也可以水解HMB-CoA生成HMB。其中，过表达yciA的菌株水解HMB- coa的能力比过表达tesB的菌株高出约30%，在24 h内达到1.29 g/L（图3B）。
除HMB外，还产生了羟甲基戊二酸(HMG)、3-甲基戊二酸(3MG)和3-甲基crotonate (3MC)等副产物，这一结果可能是由于YciA对中间体HMG-CoA、3-MG-CoA和3-MC-CoA具有广泛的特异性。然而综合评估，YciA的性能是最好的，因此后续使用YciA作为硫酯酶来生产HMB。
HMB表达载体及菌株的评估
作者使用不同的表达载体来评估不同重组质粒在HMB生产中的性能（图4A），结果显示，pSC101、ColA和CloDF的载体表现明显优于ColE1和RSF1030（图4B），高拷贝数的ColE1和RSF1030可能是由于蛋白质过量表达使得细胞代谢负担过重，进而导致产量降低。以CloDF作为复制起点的pML101重组质粒具有最高的HMB产量2.42 g/L，比之前翻倍，并且副产物减少，产率为0.28 g HMB/g葡萄糖(图4C)，增大了一倍。
接着，作者评估了不同的大肠杆菌感受态作为表达宿主时HMB的生产性能（图5A），结果表明菌株BL21(DE3)具有最高的HMB产量和最低的HMB /副产物比(图5B)。
通过敲除柠檬酸合成酶和丙酮酸氧化酶增加HMB的产量
乙酰辅酶a是HMB的代谢前体，因此去除其竞争性消耗途径可能有利于提高HMB的产量。在有氧代谢中，乙酰辅酶a通量的主要竞争途径是TCA循环和脂肪酸生物合成。由于脂肪酸的生物合成对大肠杆菌是必需的，相关基因无法被敲除，因此作者评估了抑制TCA循环的效果(图6A)。
通过敲除柠檬酸合成酶gltA，使大肠杆菌无法合成谷氨酸，然而结果表明gltA敲除对HMB的合成没有显著影响（图6B），并且菌株生成了大量的乙酸。随后作者尝试将乙酸合成相关的基因pta和poxB敲除，结果显示敲除poxB有效减少乙酸的生成并且显著增加了HMB的合成，进行发酵培养26h后可生成5.17 g/L的HMB，表明敲除gltA和poxB是将碳代谢通量集中到乙酰辅酶a并防止乙酸生成的有效策略。
培养条件优化及补料分批发酵
作者利用4种不同的发酵培养容器，对菌株BL21(DE3)/pML101生产HMB进行了厌氧、微氧和好氧等不同条件的试验。结果显示（图7），HMB产量与氧气含量成正比，厌氧条件下HMB产量只有185 mg/L并且生成了大量的副产物。
接着作者以葡萄糖为唯一碳源，将溶解氧水平保持在30%以上进行补料分批发酵，128h中HMB产量几乎线性增长，达到17.7g/L（图8A），这高于以亮氨酸为底物所获得HMB产量，接近以3-甲基丁酸为底物所获得HMB产量，考虑到亮氨酸和3-甲基丁酸的价格，该研究0.16 g HMB/g葡萄糖的转化率可能具有潜在的商业可行性。同时作者还发现，乙酸会随着其浓度的波动而被部分再同化，当葡萄糖浓度较低时，这种现象在80 h - 94 h左右尤为突出(图8B)，这一结果表明乙酸也可以作为维持细胞生长和HMB产生的碳源。分批补料发酵过程中其他次级代谢副产物是一些HMB生产途径的水解酸产物，包括HMG、3-MG和3-MC(图8C)，在补料批试验结束时产生的上述酸的总滴度约为3.2 g/L，这些酸的存在可能是YciA非特异性催化的结果。
以其他碳源生产HMB
由于HMB从头生物合成的途径中，乙酰辅酶A是唯一所需的前体化合物，而在大肠杆菌中，无论使用哪种碳源理论上都可以生成乙酰辅酶A，因此作者探究工程菌株在不同碳源下生产HMB的性能，包括甘油、木糖和乙酸等，图9A是这些碳源转化为HMB及其对应的最大理论产量的示意图。
结果表明（图9B），使用葡萄糖和木糖作为碳源，HMB产量几乎都是2g/L，对应产率分别为0.28gHMB/g和0.25 gHMB/g，约为最大理论产率的60%。使用甘油作为唯一碳源时，HMB产量较低，只有1.17 g/L，但是产率与使用糖底物获得的产率相当，为0.21 g/g。当以乙酸为唯一碳源时，产量显著降低，仅为230 mg/L，这主要是由于细胞生长(图9C)和乙酸消耗(图9D)显著降低。
综上所述，作者在大肠杆菌中成功构建了一个HMB的从头生物合成途径，通过遗传结构的优化和高效酶的筛选鉴定，在发酵罐中进行分批补料发酵后，以葡萄糖作为唯一碳源时HMB的产量达到17.7 g/L，并且以其他可再生物质如木糖、甘油和乙酸作为碳源也检测到HMB的生成，该研究为HMB的绿色生物合成提供了坚实的理论基础，具有大规模工业化应用的潜力。
