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灵芝深层液体发酵多糖的提取与测定

   日期:2011-01-12     来源:发酵工业网    作者:发酵网    浏览:2063    评论:0    
  

0 前言
灵芝是我国传统的名贵药材,富含丰富的营养,具有保健作用。灵芝多糖是其中的最有效成分之→,它能加快血液循环,提高血液供氧能力,提高肝脏、骨髓、血液合成DNA、RNA和蛋白质的能力,具有防治肿瘤等作用,市场需求量越来越大。→般灵芝多糖几乎都是从子实体中提取, 由于灵芝野生资源贫乏, 人工栽培周期长(2~3个月以上),占地面积大,又受季节限制,从而影响了灵芝的充分利用;而采用深层发酵技术生产灵芝周期短(7~10d左右),成本低,产量大,具有工业化生产前景。本文对灵芝深层液体发酵多糖的提取及分析进行初步研究,现将实验结果报道如下。
1 材料与方法
1.1 灵芝深层发酵多糖的提取
1.1.1 菌种与试剂
菌种:红灵芝由上海市食用菌研究所提供;
种子培养基:马铃薯20% 、蔗糖2% 、磷酸二氢钾、0.3% 、MgS04·7H20 0.15% 、pH值5.5;发酵培养基:玉米粉1% 、葡萄糖2% 、酵母膏0.5% 、KH2P04·3H20 0.15% 、MgS04·7H20 0.15% :
种子培养条件:250mL三角瓶培养液70mL,旋转式的摇床(165r/min),28~C条件下培养7d。
1.1.2 发酵工艺 斜面菌体→→级种子培养(250mL三角瓶装液70mL、摇床转速150r/min、28~C培养3d)→二级种子培养(500mL三角瓶装液100mL、摇床转速150r/min、28~C培养3d)→转入10L大罐中深层发酵(装料系数50% 、接种量10% 、搅拌速度150r/min,通气量1L/min、28~发酵144h)。
1.1.3 发酵上清液胞外多糖的提取
发酵液离心→发酵上清液浓缩→浓缩液透→透析液浓缩→浓缩液离心→上清液乙醇沉淀→沉淀物干燥→外多糖。
1.1.4 菌丝体胞内多糖的提取
发酵液离心→菌丝体干燥→菌丝体干粉抽提→提取液浓缩→浓缩液离心→上清液醇析→沉淀物干燥→胞内多糖。
1.1.5 粗多糖的纯化
粗多糖经sephadexA-25柱层析、NaCI梯度洗脱→含糖部分、经sephadexG-200柱层析、0.1mol/L NaC1洗脱→多糖纯品。
1.2 灵芝液体发酵多糖的测定
1.2.1 多糖的纯度鉴定
采用聚丙烯酰胺凝胶电泳和凝胶进行纯度检验
1.2.2 多糖含量的测定-苯酚一硫酸法
苯酚一硫酸试剂可与游离寡糖、多糖中的己糖、糖醛酸起显色反应,生成有色化合物的吸光度与糖含量呈线性关系。
试剂: 浓硫酸: 分析纯,96.5% ;80% 苯酚:80g苯酚加20mL水使之溶解置于冰箱中避光长期保存。以分析纯葡萄糖为标准。
2 灵芝液体发酵多糖的测定
2.1 灵芝液体发酵多糖测定条件的探讨
2.1.1 最佳波长的选择
选择好参比液,在溶液浓度和液层厚度一定的条件下,改变入射光波长,测定其吸光度,结果如图1。


2. 1. 2 显色时间的选择
选择好参比液,在其他条件已知的情况下,改变显色时间,测定吸光度,结果如图2所示:


2.1.3 选择好参比液,在其它条件下一定的情况下,改变显色温度。结果见图3。


2,1.4 结论
以苯酚一硫酸法测定发酵液中多糖含量最佳条件是:波长为497nm,显色时间为20min,显色温度30℃ 。
2.2 多糖的测定
发酵液中多糖的测定,结果如表1。


灵芝子实体多糖的测定,结果如表2。

从以上结果看出:从菌丝体中提取的多糖与子实体中的多糖有相同的数量级,约为干重的0.5% ~2.5%之间,同时上清液中还含有丰富的胞外多糖,若以每升发酵液的菌丝干重15.1计,则发酵液所含的多糖总量为3.48g/lOOg干菌体,略多于100g子实体中提取的冷水溶多糖,这说明以发酵方法制取灵芝多糖是很可取的。

 
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