摘要：哺乳动物细胞的大规模培养技术是利用哺乳动物细胞生产基因工程药物、抗体药物、疫苗、基因治疗药物等产品的一项关键技术。为了实现规模化、产业化，达到精密控制生产过程、降低药品成本、便于下游工作及提高生物制品安全、质量等需求，不断优化细胞培养技术、优化和选择适宜的细胞培养基显得尤为重要。提高生物制品表达率，降低甚至完全排除动物组分、使用化学成分明确的细胞培养基是发展趋势。
随着生物技术的发展，动物细胞大规模培养技术也在不断发展，相应的，细胞培养基也是在不断发展的。
关键词：生物制品；细胞培养；培养基
动物细胞大规模培养技术是生物技术领域的重要组成部分，它是用动物细胞体外培养和扩增来生产一系列表达的生物产品，或者作为发现和测试新药工具。
一．生物制品的发展依托和促进细胞培养技术的发展
生物技术引入医药产业，使得生物医药业成为最活跃、进展最快的产业之一。以基因工程、细胞工程、发酵工程、蛋白质工程等为代表的现代生物技术近20年来发展迅猛，并日益影响和改变着人们的生产和生活方式。
最早的生物制品是采用传统的生物化学技术从动物组织获取的，如生物提取的生长激素、干扰素、单克隆抗体、疫苗及白细胞介素等。然而，随着社会经济的发展，人类对生物制品的需求激增，传统提取的生物制品产量和质量已远远满足不了这一需求，于是，通过大规模规模培养动物细胞生产生物制品便被提到议事日程上来。
工业用动物细胞培养基与实验室培养基基本一致。自从1907年Harrison在世界上首次将青蛙的神经组织在试管内培养成功以来，即拉开了动物细胞体外培养技术的序幕。最初组织培养使用的是天然培养基，如胚胎浸出液、血浆等，后来较常用的是水解乳蛋白和血清，培养的细胞主要是原代细胞，并利用这些细胞分泌病毒研发、制造人用和兽用疫苗。
采用天然培养基的原因，一方面是1950年以后才发明合成培养基，另一方面合成培养基在面世后相当长的时间里价格昂贵。
第一代细胞培养技术核心问题是难以产业化或者说是规模化生产，体现在：
1．在工艺生产时不能大规模制备产品；
2．非批量生产容易导致产品质量的不均一性；
3．难以对同批生产进行生产和质量控制。
随后，利用199、MEM等合成培养基在转瓶中培养Vero细胞、BHK21细胞等传代细胞，被应用于疫苗的研发和生产，解决了几个问题：
1．细胞来源以及细胞的优化筛选；
2．大规模细胞培养，提高生产能力；
3．减少了动物来源培养基的使用，便于生物制品的下游生产；
如60年代初，英国AVRI研究所在贴壁细胞系BHK-21中将口蹄疫病毒培养成功。
由于动物细胞培养技术在规模和可靠性方面都不断发展，且从中得到的蛋白质也被证明是安全有效的，因此人们对动物细胞培养的态度已经发生了改变。许多人用和兽用的重要蛋白质药物和疫苗，尤其是那些相对较大、较复杂或糖基化的蛋白质来说，动物细胞培养是首选的生产方式。
随着生物制药的发展，采用玻璃瓶静置或旋转瓶的培养方法，已不能满足所需细胞数量及其分泌产物。因而必须为工业化生产开创一种新的技术方法。自70年代以来，细胞培养用生物反应器有很大的发展，种类越来越多，规模越来越大，较常见的细胞培养生物反应器有空气提升反应器、中空纤维管反应器、无泡搅拌反应器及篮式生物反应器等。八十年代以来，人们逐渐开始以生物反应器培养代替鼠腹水的方法获得单克隆抗体。
在生物制品生产中动物细胞培养己越来越重要，而动物细胞培养的最主要设备就是生物反应器。由于动物细胞(尤其是哺乳动物细胞)在促红细胞生成素(EPO)、干扰素(IFN)、尿激酶原(Pro-UK)、疫苗，尤其是抗体药物等价值昂贵的生物制品的生产上具有独特的优势。因此近年来有关动物细胞生物反应器的研制进展迅速。目前国内外生物反应器的种类较多，如：机械搅拌式生物反应器、气升式生物反应器、中空纤维管生物反应器、旋转式细胞培养系统、摇床式生物反应器等。
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新型动物细胞培养用生物反应器 |
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用途 |
种类 |
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悬浮培养用 |
空气提升式反应器、笼式通气搅拌罐、中空纤维管 |
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贴壁培养用 |
玻璃珠床、中空纤维管、笼式通气搅拌罐（微载体系统） |
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包埋培养用 |
流化床（海绵基质）、固定床生物反应器 |
1983年，英国Wellcome公司就已能够利用5000L的细胞罐大规模培养技术进行大规模培养生产口蹄疫疫苗。
美国Genentech公司应用SV40为载体，将乙型肝炎病毒表面抗原基因插入哺乳动物细胞内进行高效表达，已生产出乙型肝炎疫苗。
英国Wellcome公司采用8000L Namalwa细胞生产α干扰素。
英国Celltech公司用气升式生物反应器生α、β和γ干扰素；用无血清培养液在10000L气升式生物反应器中培养杂交瘤细胞生产单克隆抗体。
美国Endotronic公司用中空纤维生物反应器大规模培养动物细胞生产出免疫球蛋白G、A、M和尿激酶、人生长激素等。
现在，利用无血清无动物组分细胞培养基在1000L甚至更大容量的反应器中培养CHO悬浮细胞、NS0悬浮细胞，表达各种抗体药物，已成为生产抗体药物的关键手段。
二．细胞培养技术是提高生物制品竞争力的核心
不论是疫苗生产，还是抗体药物生产，采用更先进的细胞培养技术和培养基，提高单位体积培养液中疫苗或抗体的表达量，以提高生产能力、降低生产成本、减少固定资产投资，是所有利用细胞生产生物制品的企业不断努力的重点工作。
根据美国生物技术的理念和实践、国内抗体企业和部分疫苗企业的经验，可以归纳如下提高生物制品产率的途径。
1．细胞与产率
筛选细胞是抗体表达技术的第一个重点。同样，作为生物制品生产的载体，筛选优良的细胞种子，可以生长好、维持寿命长、表达高，取得生产效率的先天优势。
2．培养液与产率
营养丰富的细胞培养基可以缩短细胞生长周期从而缩短生产周期，可以增加细胞密度、增加收获次数、提高表达量，从而提高生物制品的产量。同时，还可以大幅度降低新生牛血清使用量，减少血清带来的问题。
另外，营养丰富的细胞培养基还是细胞筛选的关键营养物质。
3．设备与产率
选择高密度细胞培养设备是提高生产效率的又一个关键，例如，利用已投资的大量转瓶机配合新型多层转瓶，获得高密度细胞培养是可行的，细胞密度可提高200％。
在新设备选择方面，除常见的反应器之外，国际上还有很多高密度细胞培养技术和设备，如细胞密度可达1011的Hollow Fiber中空纤维细胞培养系统，同样值得借鉴甚至选择。
4．过程控制与产率
生物制品生产过程比较复杂，应该不断监测、分析细胞培养情况以及病毒产量的过程数据，不断优化生产工艺条件和参数。
三．细胞培养基的发展是细胞培养技术发展的关键
动物细胞大规模培养技术是指在人工条件下（设定pH、温度、溶氧等），在细胞生物反应器中高密度大量培养动物细胞，并用于生产生物制品的技术。目前可大规模培养的动物细胞有鸡胚、猪肾、猴肾、地鼠肾等多种原代细胞、人二倍体细胞、CHO（中华仓鼠卵巢）细胞、BHK-21(仓鼠肾细胞)、Vero细胞(非洲绿猴肾传代细胞，是贴壁依赖的成纤维细胞)等，并已成功生产了包括狂犬病疫苗、口蹄疫疫苗、甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、红细胞生成素、抗体药物等产品。在过去几十年来，该技术经有了很大发展，从使用转瓶等贴壁细胞培养，发展为生物反应器进行大规模细胞培养。
而动物细胞大规模培养技术发展的基础就是细胞培养基，包括高表达的细胞系也是通过细胞培养基驯化筛选得来的。
细胞培养基从早期的鸡胚汁发展到天然培养基，到合成培养基，再到现在的低血清培养基、无血清培养基、无蛋白培养基、限定化学成分培养基，经过近百年的历史，虽然还存在需要解决的问题，但已经发生质的飞跃。
1．天然培养基
最初组织培养使用的是天然培养基，如胚胎浸出液、血浆等，对细胞生物学的研究起到了推动作用。在对细胞生理学等方面的研究之后，发现了细胞所需的营养条件及生长环境，研究者模拟、借鉴细胞在体内生存生长的各种条件，设计出类似体内环境而适宜细胞在体外生存的各种培养基。
2．合成培养基
合成培养基可维持细胞体外长期生存，其组成成分明确，便于精密地测定培养的细胞与培养液内物质变化的情况，便于控制和调整实验设计并使培养条件标准化。通过调节各种成分的种类和数量，再借观察细胞生物性状反应性变化，能测知细胞与外界环境的关系，可借以了解细胞的生存条件，并可诱导细胞进行定向分化等。合成培养基的应用，推动了组织培养的发展。
3．低血清培养基
对于一些贴壁型细胞，如Vero细胞，不论其在转瓶还是在微载体反应器中培养，使用营养丰富的低血清培养基可以有效降低培养液中的牛血清使用量，并能提高细胞密度，提高生物制品的产率。低血清细胞培养基的使用还可以减少牛血清带来的质量和安全问题，降低培养液成本。
4．无血清培养基
无血清培养基的出现是培养基的发展历程上的一个里程碑。无血清培养基完全采用人工合成的化合物，是成分确定的培养液。在理论研究中应用无血清培养技术可以排除含血清培养时血清中许多未知因素的干扰，使实验结果更为可靠；可能发现一些在有血清培养中不容易发现的因子，如细胞生长调节因子、激素等。反过来，细胞生长调节因子的研究又为无血清培养提供理论依据。在生物制品的生产中应用无血清培养，可提高生物制品的质量、纯度，方便产物的分离纯化，减少由血清带来的污染机会，减少过敏源，同时也减少了成本，也便于在生物反应器中进行代谢流分析，实施在线过程监控，精确投料。另外在人类细胞培养中，某些细胞在无血清的条件下，其生长和抗体的产量甚至比有血清的培养基高出数倍，同时应用无血清培养基还能有选择性地控制及避免成纤维细胞的过度生长。多种细胞可在无血清供应的情况下生长，尤其是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、杂交瘤细胞及重组骨髓瘤细胞等。
5．个性化培养基
个性化培养基在国外生物制药企业被普遍采用，世界著名的生物制药公司多和培养基企业合作，研制最适合自身需要的个性化细胞培养基。
2005年全球爆发禽流感,导致整个世界对疫苗产业重新定位。在变革疫苗工业的呼声里，最有可能最先到关注和资金投入的是疫苗的细胞培养部分。即用人或其他哺乳类动物肾脏中提取的细胞作为介质，培植疫苗活体。这种方式将培养时间缩短了一半，还避免了卵胚被污染或缺乏所带来的不便，尤其是当面对像Ｈ５Ｎ１这类病毒时，细胞培植优势就更加明显。
美国政府对此类非卵胚培养技术的开发投资占到总投资额70亿美元的40％。
生物技术在不断发展，细胞培养技术在不断发展，细胞培养基也是在不断发展的。
作为动物细胞大规模培养技术研究和细胞培养基生产的专业机构，北京清大天一生物技术有限公司建立了动物细胞大规模培养开放式技术平台，为生物制药研发和生产单位服务，在Vero细胞、BHK21细胞、二倍体细胞、CHO细胞、NS0细胞等细胞的大规模培养技术研究方面做了大量努力，在多层转瓶、反应器中采用低血清培养基、无血清培养基培养细胞，取得了良好的效果。
随着生物技术的进一步发展，人们还将不断努力研究细胞大规模培养技术，开发新的细胞培养基，使细胞的生长状态更好，生物制品产率更高，生物制品更安全，生产成本更低。
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