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维生素C生物发酵

   日期:2011-01-12     来源:发酵工业网    作者:发酵网    浏览:2382    评论:0    
  
VC既抗坏血酸,是人体必须的一种维生素,生理作用广泛,是一类重要的细胞代谢氧化一还原化合物,在医学上也有重要用途,在食品上用于抗氧化剂,烘熔剂,此外,还作为饲料添加剂和某些作物的催熟剂,在化妆品中也有应用。
随着VC应用范围的增加,市场需求量日益增大,促使人们对VC生产技术不断进行研究改进,VC生产技术的发展经历了浓缩提取、化学合成和生物发酵三个阶段。在30年代以前,VC是从柠檬中提取的,价格昂贵,远不能满足人们的需要。1933年德国Reisehstein等用化学合成法提取VC获得成功,后进一步改进为由一步发酵和化学合成来生产VC,此方法通称为莱氏法,这种方法是以葡萄糖媒促还原所制备D一山梨醇为原料,由生黑葡萄糖酸杆菌或醋酸杆菌属的某些菌株发酵产生L一山梨糖,经过酮化,化学氧化和水解几步反应过程即可得到VC的重要前体一2一酮基一L古龙酸,再经转化生成VC,目前国外几家主要的生产VC的公司都采用此方法。虽然莱氏法工艺路线成熟,原料简便易得,产品质量好,收率高,但此方法工艺线路长,难以连续化操作,且需耗费大量有毒、易燃、易爆的化学药品,既危险又污染环境,因此自60年代以来,各国科学家又开始探索以微生物转化法取代莱氏法并已经取得较大的成功。目前较有前途的发酵方法有:二步发酵法、新二步发酵法和一步发酵法。
1 二步发酵法
二步发酵法是美国的Tengerdy和Huang等首先发现的,其经过的是L一山梨糖的途径,即L一山梨醇先经过细菌转化的L一山梨糖,后者再经过细菌发酵生成VC前体2一KGA。国外的二步发酵法研究较早,L一山梨糖代谢途径和代谢机制研究也比较深入,但是由于其2一KGA转化率低而至今未被用于生产实践。我国VC二步发酵法是由中国科学院微生物研究所和北京制药厂合作予70年代初发明的,它是目前唯一成功应用于VC工业生产的微生物转化法,该办法属L一山梨糖途径,其特点为第二步发酵由氧化葡萄糖酸杆菌和巨大芽孢杆菌等伴生茵混合发酵完成。我国最初筛选出的一组能利用L一山梨糖产生2一KGA的优良菌株是氧化葡萄糖酸杆菌及其伴生茵条纹假单孢茵,以后经不断实践改进,1976年6月通过中试鉴定并逐渐在全国范围内推广使用。该法大都采用液体物料反应,为实现工业生产过程的机械化、连续化、自动化创造了有利条件。
我国VC二步发酵法涉及小菌和大茵两个菌株,其中小茵为产酸茵,但单独培养传代困难,而且产
酸能力很低,大茵不产酸,但可以促进小茵生产和产酸,为小茵的伴生茵。由研究证实,大茵胞体液和胞外液茵均可以促进小茵生长,缩短小茵生长的延迟期。大茵的胞外液可促进小茵产酸,说明大茵通过释放某些代谢活性物质促进小茵产酸,现已经从大茵胞外液中分离出一种可促使小茵产酸的蛋白,该活性蛋白的形成规律和作用机制尚在探索中。
在二步发酵法中,参与第一步发酵的酶是:L一山梨醇脱氢酶,该酶存在于细胞膜上,是膜结合酶,由4个分子量为58KDa的相同亚基组成,属黄素蛋白,与细胞色素紧密相连,对L一山梨糖有很高的专一性,可被I 一山梨糖或D一山梨醇诱导合成。参与第二步发酵的酶是L一山梨酮氧化酶,它主要存在于胞质中,L一山梨酮是其最适应物,酶活为NAD+或NADP+所加强。
2 新二步发酵法
新二步发酵法是13本园山高康等发明的,也称葡萄糖串联发酵法,遵循的是葡萄糖一2,5一二酮基葡萄糖酸合成途径,此发酵过程由2种微生物完成,第一种微生物直接氧化D—G,生成2,5一二酮基一D一葡萄糖酸(2,5DKG),再由另一种微生物将2,5DKG还原生成2一KGA。将能够氧化D—G积累,2,5DKG和还原2,5DKG生成2一KGA菌株进行串联发酵,即为新二步发酵法。
山高康用欧文氏菌S I290o将葡萄糖氧化为2,5一二酮基葡萄糖酸,用棒杆菌SH75200将2,5一二酮基葡萄糖酸还原为2一酮基一L一古龙糖酸。欧文氏菌发酵培养3 h后,每隔4.5 rain补加14.灭菌葡萄糖溶液(50%),共补加12 h,培养26 h后,2,5一二酮基葡萄糖酸钙达329吕/l,对投入葡萄糖转化率达94.5%,发酵结束后添加7.27 kg 14.4%SDS,28~C搅拌(8o r/min)6h,SDS可使欧文氏菌几乎完全死亡,可不必过滤除菌或加热灭菌即可用于第二次发酵。SDS还促进棒杆菌还原2,5一二酮基葡萄糖酸,处理完毕后发酵液冷却lO℃备用,使用前加少量葡萄糖作为还原2,5一二酮基葡萄糖酸时的供氢体,棒杆菌发酵培养18 h后,生长达到高峰,开始流加2,5一二酮基葡萄糖酸,控制培养基中底物浓度小于5舀/l,流加持续48 h,流加完毕,92.5%的2,5一二酮基葡萄糖酸钙转化为2一酮基一L一古龙糖酸钙,浓度为107 g/1。
新二步发酵法省略了从D—G加氢生成D一山梨醇的步骤,大大简化了莱氏法的工艺程序,原料方面也比我国的二步发酵法有所简化,收率也很高,很有应用前途,但此法在生产上还存在很多问题,与工业生产还具有一定距离。
3 一步发酵法
一步发酵法为由葡萄糖氧化直接生成2KGA的过程,称2一酮基一L一古龙酸途径,此合成途径简单,但能够完成此转化的菌株至今尚未在自然界中发现,人们在尝试用基因工程手段获得一步发酵生产菌株,通过基因工程将欧文氏和棒状杆菌相关的特性,结合于1种微生物种,只需要单菌一步发酵便可实现由葡萄糖到2KGA的转化。
1985年Amderson等人纯化了棒状杆菌ATCC31090中2,5一DKG还原酶I,分析了该酶N端氨基酸顺序,人工合成兼并探针。用原位杂交法从部分基因文库筛选出不完全的一个基因片段。然后,用已知片段为探针克隆到完整的基因。插入能在大肠杆菌中有效作用的Trp启动子和人工合成的核酸体结合位点(RBS),使之有效表达在前一步发酵产生菌草生欧文氏菌中,在lL发酵缸中生成2一KGA,转化率为33.3%。但是由于基质浓度太低,仅获得is/l的产物。l987年瑞士的Hardy也用类似的方法,获得一步发酵人工菌株,1 L罐发酵转化率为49.4%。我国的陈策实、尹光琳也在进行这方面的研究。目前,一步发酵法还存在相当多的问题,距实际应用尚有距离,但这是一个很有前景的方法,相信随着分子生物学技术和微生物学的发展,在工业规模上实现葡萄糖直接发酵生产VC是完全可能的。

 
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