衣康酸化学名称亚甲基丁二酸，其分子内部含有两个活泼的羧基和一个双键，双键与羧基呈共轭关系，化学性质非常活泼，除可自身聚合外，还可以和不同数目的其它单体聚合，合成高分子聚合物，因此广泛应用于化学合成工业。衣康酸最早是由Baup等人于1836年在蒸馏分解柠檬酸时发现的。1926年，13本人木下广野在一种嗜高渗透压的霉菌培养物中发现了衣康酸，并命名这种曲霉为衣康酸曲霉(Asp．itaconicus)，从此揭开了微生物发酵生产衣康酸的研究历史。利用糖质原料经土曲霉发酵生产衣康酸，原料来源丰富，生产工艺简单，生产成本低，是目前最科学、最经济的衣康酸生产方法。
本文报道了以实验室保藏土曲霉菌株No．201为出发菌株，经紫外线、亚硝基胍、硫酸二乙脂等诱变剂处理获得衣康酸高产突变株HAT418的研究过程和结果。
1 材料与方法
1．1 出发菌株
实验室保藏菌种：土曲霉No．201(Aspergillusterreus No．201)
1．2 培养基
1．2．1 平板、斜面培养基(g／L)
蔗糖 30 K2HPO4 40 NaNO3 3 MgS04*7H20 0.5 KC1 0.5 FeS04*7H20 0.01 琼脂 20
1．2．2 种子培养基(g／L)
葡萄糖 40一50 NH3NO3 4.0 MgS04．7HzO 4．0 K2HPO4 1 FeSO4*7H2O 0.04 ZnS04*H20 0.02
玉米浆 1 pH4-5
1．2．3 发酵培养基
玉米淀粉水解糖lO00ml(葡萄糖120g左右)NH3NO3 2.0 g MgSO4*7H2O 8.0g NaCl 3g FeS04*7H20 0.04 ZnS04*H20 0.02 CaC1z*HzO 0.1 玉米浆 1.5g pH 4.0—4.5
1．3 诱变方法
1．3．1 单孢子悬液的制备
用lOml无菌生理盐水洗下成熟的斜面孢子，用弹子瓶打散，无菌脱脂棉过滤，调整孢子浓度为l06—1o8个／ml。根据采用的诱变因子不同，选择不同pH值的缓冲液代替上述生理盐水制备孢子悬液。
1．3．2 紫外线(uv)诱变处理
取单孢子悬液8ml，用l5瓦紫外灯照射，照射距离30cm，照射时间分别为3、4、5分钟，适当稀释后涂布平板，35—37~C避光培养。
1．3．3 亚硝基胍(NTG)诱变处理
取0．1％ 的亚硝基胍处理液lOml，加入lOmlpH6．0磷酸缓冲液配制的孢子悬液，30℃保温
振荡处理25—60分钟，每5分钟取样一次，适当稀释后涂布平板，35—37~C保温培养。
1．3．4 高温诱变处理
吸取5ml孢子悬液，放入预先调至不同温度的恒温水浴锅中，保持一定的时间，处理完毕后立即冷却，适当稀释后涂布平板，35—37~C保温培养。
1．3．5 硫酸二乙酯(DES)处理
吸取50％的硫酸二乙酯乙醇溶液0．2ml，放入250ml碘量瓶中，加入pH7．2的磷酸缓冲液
5ml，单孢子悬液5ml，于36~C振荡处理50、60、70分钟，处理完毕后加入l rnl 25％的硫代硫酸钠溶液终止反应，适当稀释后涂布平板，35—37℃恒温培养。
1．4 筛选方法
1．4．1 形态筛选法
实验表明：在平板培养基上生长形成的菌落小、分生孢子稀少且平板背面分泌色浅的菌株为
产酸较优菌株，跟据这一形态特点挑取菌落，移接斜面进行摇瓶筛选。
1．4．2 高酸、高渗透压平板筛选法
将平板培养基灭菌后冷却至55℃左右时，加入8％(w／v)的衣康酸或衣康酸钠盐，溶解后倒平板立即冷却，使琼脂凝固，制备成高酸或高渗透压平板，涂布处理后的孢子悬液，36℃恒温培养，挑取单菌落，进行摇瓶筛选。
1．4．3 摇瓶初筛
将培养成熟的斜面孢子接种到摇瓶培养基中，500 ml三角瓶装液量5Oral，每株接一瓶，36℃ 、200rpm摇瓶发酵72小时，测定产酸率，结合纸层析结果，挑选较优菌株，进行复筛。
1．4．4 摇瓶复筛
摇瓶初筛选出的较优菌株传代后，一株接三瓶进行摇瓶发酵，挑选产酸率高、纸层析结果杂酸斑点小和少、平行实验结果好的菌株。
1．5 测定方法
1．5．1 发酵液总酸的测定
酸碱滴定法
1．5．2 发酵液中衣康酸的测定
碘法测定。
1．5．3 衣康酸定性测定
展开剂：正丁醇：甲酸：水=6：1．5：8
显色剂：甲基红一溴酚蓝溶液
1．5．4 高压液相色谱分析
柱：碳18，100X4.6mm
流动相:0.5％磷酸二氢铵溶液pH2.5—2.6 (用磷酸调节) 流速:1ml／min 检测:紫外检测器
1．5．5 总糖测定
快速滴定法
1．5．6 还原糖测定
裴林试剂滴定法
2 结果与分析
2．1 高产衣康酸土曲霉突变株的选育
2．1．1 高产衣康酸土曲霉突变株选育谱系
Asp．terreus No．201 产酸 16．7 L
Asp．terreus 1—120 产酸23．1 g／L
Asp．terreus 2—20—9 产酸59．1 g／L
Asp．terreus 3—80—93 产酸62．5 L
Asp．tetTel1．$4—40—80 产酸72．1 g／L
Asp．tetTel1．$HAT418 产酸81．4—101．1 g／L
2．1．2 菌种诱变结果
2．1．2．1 紫外线(uv)诱变处理
经紫外线诱变处理后，经平板筛选，共挑取斜面292支，经过初筛选出产酸高于出发菌株的正向突变株24支，将其中产酸提高20％的8支突变株进行复筛，结果见表1。
表1 asp．terreus No．201 UV处理复筛结果
|
菌号 |
初筛产酸g／L |
复筛产酸g／L |
|
1—9 |
20．1 |
17．2 |
|
1—18 |
21．1 |
16．3 |
|
1—51 |
20．0 |
08．7 |
|
1—60 |
21．5 |
15．1 |
|
1—120 |
21．7 |
23．1 |
|
1—241 |
23．1 |
14．1 |
|
1—278 |
20．5 |
09．1 |
|
1—282 |
22．7 |
22．4 |
|
No．201 |
16．7 |
|
由表1结果可以看出1—120、1—282复筛产酸分别达到23．1 L和22．4g／L，且纸层析检不出杂酸斑点。经过多次分离，1—120菌株产酸稳定在22 L以上，选作下一轮诱变的出发菌株。
2．1．2．2 亚硝基胍(NTG)诱变处理经亚硝基胍处理后，经平板筛选，共挑取斜面528支，经过初筛选出28支产酸高于22．0#L的正突变株，将其中6支产酸高于30．0#L的突变株进
行复筛，结果见表2。
表2 asp．terreus 1—120 NTG处理复筛结果
|
菌号 |
初筛产酸g／L |
复筛产酸g／L |
转化率％ |
|
2—23—5 |
46．5 |
48．6 |
40．50 |
|
2—197—7 |
31．5 |
29．5 |
|
|
2—4—7 |
46．8 |
42．1 |
35．08 |
|
2—86—4 |
30．5 |
19．3 |
|
|
2—20—9 |
58．6 |
59．1 |
49．25 |
|
2—14—8 |
31_8 |
29．7 |
|
|
1—120 |
|
22．1 |
|
经亚硝基胍诱变处理，筛选到一株高产衣康酸突变株2—20—9，产酸达59．1g／L，比出发菌株提高2．6倍，诱变效果非常明显。发酵液纸层析检测不到杂酸斑点，菌株产酸性能优越，经多次分离后菌株突变性状稳定，继续做下一轮诱变处理。
2．1．2．3 高温处理
经平板筛选，共挑取菌株187支，经初筛、复筛选出3支正向突变株，结果见表3。
表3 asp．terreus 2—20—9高温处理复筛结果
|
菌号 |
初筛产酸g／L |
复筛产酸g／L |
转化率％ |
|
3—75—18 |
59．4 |
58．9 |
49．08 |
|
3—75—81 |
59．7 |
59．0 |
49．17 |
|
3—80—93 |
60．1 |
62.5 |
52．08 |
|
2—20—9 |
|
59．0 |
|
其中3—80—93菌株复筛产酸为62．5#L，经分离后产酸稳定在61．0#L以上，作为下一轮诱变的出发菌株。
2．1．2．4 硫酸二乙酯(DES)处理
硫酸二乙酯(DES)诱变处理，经平板筛选，共挑取斜面491支，经初筛得到11支正向突变株，反复筛选得到三支产酸性能较优菌株结果见表4。
表4 asp．terreus 3—80—93 DES处理复筛结果
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菌号 |
初筛产酸g／L |
复筛产酸g／L |
衣康酸含量％ |
转化率％ |
|
4—40—80 |
70．7 |
72．1 |
98．6 |
60．08 |
|
4—68—01 |
66．7 |
67．3 |
98．3 |
|
|
4—281—68 |
67．9 |
67．5 |
97．7 |
|
|
3—80—3 |
61．0 |
52．08 |
|
|
其中4—40—80突变株以12％的玉米淀粉水
解糖为碳源，发酵结束产酸72．1 g／L、糖酸转化率达60．08％。4—40—80突变株经多次自然分离，得到一株性状稳定的高产菌株，编号命名为Asp．terreu．$HAT418。通过培养基及发酵条件优化(待报)，菌株以葡萄糖为原料发酵产酸达81．4—101．1 L，糖酸转化率63．18—67．83％ ，衣康酸含量98—99％。
2．2 突变株HAT418生长特性研究
2．2．1 突变株HAT418与No．201菌株特征比较经过多次诱变获得的高产衣康酸突变株土曲
霉HAT418与其出发菌株相比，菌体生长速度变慢，生孢子能力下降，孢子颜色变浅，耐酸性增强(见表5)。
2．2．2 突变株HAT418碳源利用情况以不同的碳源代替察氏培养基中的蔗糖，将土曲霉突变株孢子点种到平板中央，36~C培养观察菌落的生长及产孢子情况。实验结果表明HAT418
突变株可以利用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、菊糖、木糖、纤维二糖、棉子糖、甘露糖山梨糖、鼠李糖、甘露醇、可溶性淀粉、糊精作为碳源生长。葡萄糖、淀粉水解糖、蔗糖是良好的发酵糖源。
表5 突变株HAT418与出发菌株No。201部分特性比较
|
|
HAT4l8 |
No。20l |
|
产酸g／L |
72．1 |
16。7 |
|
产孢子能力 |
差 |
强 |
|
孢子颜色 |
浅土色 |
深土色 |
|
分泌色素 |
深 |
浅 |
|
孢子团形状 |
圆形 |
圆柱形 |
|
酸性平板生长情况 |
在8％的衣康酸平板上能生长，不产孢子 |
在8％酸平板上不能 生长 |
2．2．3 突变株HAT418氮源利用情况
以不同的氮源代替察氏培养基中的NaNO3，将突变株土曲霉HAT418孢子点种到平板中央，36~C
培养观察菌落的生长及产孢子情况。实验表明，HAT418可以利用NH4cl、(NH4)2SO4、NH4NO3、
NaNO3、KNO3、谷氨酸钠、干酪酸、尿素等作为氮源，其中KN03、NI-hNO3、(NI-h)2SO4为氮源时生长较其它供试氮源好。
2．2．4 温度对突变株HAT418生长的影响
将土曲霉突变株的孢子点种平板，分别放置不同的温度下培养，观察菌落生长及产孢子情况。结果表明HAT418突变株的生长温度范围为10—45cC，最适生长温度为34—38cC，高于42cC时，生长缓慢，产孢子能力下降。
2．2．5 培养基PH值对突变株HAT418生长的影响
配制不同pH培养基，然后点种突变株孢子，置36cC培养，观察菌落生长及产孢子情况。结果表明HAT418在pH值3．0—7．0范围的平板上生长良好，最适生长pH值为4．5—6．0。
2．2．6 突变株HAT418的稳定性考察
突变株的遗传稳定性主要从斜面传接代数和斜面菌种冷藏时间两个方面来考察。在试管斜面上，将高产衣康酸突变株HAT418连续传接10代，然后进行摇瓶发酵，结果显示该菌株连续传接10代产酸能力基本不变，稳定性非常好，结果见表6。
表6 突变株HAT418传代实验结果
|
传接代数 |
l |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
|
产酸g／L |
72。l |
7l。7 |
72．9 |
70．9 |
7l。4 |
71。9 |
72。l |
70。9 |
72．4 |
7l。3 |
将突变株HAT418成熟斜面置于4~C冰箱内保藏，每隔一段时间取出不经活化直接接种摇瓶发酵，考察其产酸能力的变化，结果见表7。实验表明突变株斜面在4~C冰箱冷藏3个月产酸率下降4％，下降幅度不大。
表7 突变株HAT4184℃冷藏实验结果
|
保存天数 |
0 |
20 |
40 |
60 |
80 |
l∞ |
l20 |
|
|
产酸 |
L |
72．1 |
71．7 |
71．9 |
71．1 |
7l_3 |
70．1 |
69．0 |
3 结论
3．1 以实验室保藏菌株土曲霉No．2．01为出发菌株，经紫外线、亚硝基胍、高温、硫酸二乙脂等诱变剂处理和自然分离，获得一支衣康酸高产突变株土曲霉HAT418，产酸72．1g／L，糖酸转化率60．08％，发酵条件优化后以120—1印 L淀粉水解糖为碳源，发酵72小时产酸可达81．4—101．1g／l，糖酸转化率为68．18—67．83％，发酵液经纸层析和高压液相色谱分析衣康酸纯度高，占总酸98—99％。
3．2 经菌种传代和保藏实验证明突变株HAT418突变性状稳定，适合工业化生产的要求。
3．3 通过对突变株HAT418碳源和氮源的考察，结果表明该菌株碳源、氮源利用范围广，适合多种原料的衣康酸发酵生产。
参考文献(略)
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