在栀子黄色素的生产过程中，黄色素要经过大孔树脂吸附，而栀子甙类等物质被洗脱下来，得到栀子黄废液。栀子黄废液中除含有大量的糖类物质外，还含有大量的栀子甙等。据Fujika~ 等人的研究发现，栀子甙经0一葡萄糖苷酶(EC3，2，1，21)水解成京尼平(Genipin)，京尼平与氨基酸反应能生成蓝色色素⋯ ，即为栀子蓝色素(Gardenia blue)。
有关栀子蓝色素的发酵工艺研究报道较多，傅向阳等对杆菌发酵栀子黄废液产栀子蓝色素进行了研究，肖亚中等 研究了红曲霉发酵栀子蓝色素的生产工艺，李世杰等研究了一株丝状真菌发酵栀子蓝色素的工艺条件，对于栀子蓝色素的分离纯化工艺的研究则较少，国内文献报道一般将发酵液过滤、喷雾干燥后即得栀子蓝色素产品，纯度较低，皿一EUN PARK等研究了用Bio—Gel P一2树脂通过柱层析法对栀子蓝色素进行分离纯化，得到GM1一GN5五个组分。另一方面，对发酵过程中栀子蓝色素的转化率的系统研究报道也较少。本实验选用字佐美曲霉(d— umm／i)为产酶菌株，对发酵培养基配方、发酵工艺条件与栀子蓝色素转化率之问的关系进行了较系统的探讨，并研究了离子交换树脂分离纯化栀子蓝色素的方法，获得了高色价的栀子蓝色素产品。
l 材料和方法
1．1 材料
1．1．1 菌种及主要试剂
字佐美曲霉Asergd／us umm／iAS3．758(中科院微生物所)；栀子甙标准品(中国药品生物制品检定所，编号749—200108)；栀子(江西天顺生态农业有限公司)：G一葡萄糖苷酶(WorthingtonBiochemicalCorporation，3．4U／rag)；D301为沧州宝恩化工厂产品；其它试剂均为分析纯，所用水均为去离子水。
1．1．2 培养基及标准溶液
种子培养基：马铃薯250g，葡萄糖20g，水1000mL，121℃灭菌20rain备用；发酵培养基：4％栀子黄废液、0．4％ HPO4、0．3％NaNO~、pH6．5；0．132mg／mL京尼平甙标准溶液( 为9．0)；O．2Ⅱ mL 8一葡萄糖苷酶溶液。
1．1．3 仪器与设备
UV751GD型紫外可见分光光度计；GL一20G—I恒温振荡培养箱(广东医疗器械厂)；高速冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂)；PHS一25B数字酸度计(上海大普仪器公司)
1．2 实验方法
1．2．1 菌种制备
从活化斜面上挑起菌种到种子培养基中，25Oral三角瓶装液30mL，29℃、200r／rain，振荡培养24h，然后过滤收集菌丝，并用少量蒸馏水洗涤菌丝，除去菌种表面少量培养基，再用等体积的0．85％NaC1溶液悬浮菌体，备用。
1．2．2 栀子黄废液发酵转化生成栀子蓝色素
将步骤1．2．1所得菌丝悬液以一定接种量接入发酵培养基中，按25Oral三角瓶装液3OraL，29℃、pH 6．5、200r／min，振荡培养36h，发酵结束后置于5o℃水解4h，过滤除去菌丝，滤液中加入0．7％谷氨酸钠，80 C反应1h，即得栀子蓝色素 J。
1．2．3 栀子蓝色素的测定方法
取1．2．2栀子蓝色素发酵液，稀释适当倍数，用lena比色皿以蒸馏水为空白，在分光光度计上取波长59Onm，测其吸光度值，栀子蓝色素含量与吸光度值成正比。用薄层层析法检测栀子蓝色素的纯度。
1．2．4 栀子蓝色素转化标准曲线的制定及转化率的定义取0D238为一定值的栀子甙标准液2．0mL，混匀后再加入1．0mL B一葡萄糖苷酶溶液，50℃水浴水解4h，然后再加入1．0mL 1％谷氨酸钠溶液，80℃水浴中反应1h，然后在59Onm波长下测定吸光值，以0D238为x轴，OD590 为Y轴作图，即为栀子蓝色素转化标准曲线。
转化率的定义：假定栀子蓝色素转化标准曲线中OD值[下称OD590(标)]与0 值[下称OD238 (标)]之比为100％的转化率，栀子黄废液初始0D238值称0D238(试)，按步骤1．2．2发酵转化后，测溶液0D590值称0D590(试)，栀子蓝色素转化率定义如下：
2 结果与讨论
2．1 发酵液水解时间对栀子蓝色素产量的影响
取栀子黄废液适量，接入步骤1．2．1菌种，发酵36h后，置于50℃水浴，分别水解2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、18h后，过滤除去菌丝，滤液中加入0．7％谷氨酸钠，80℃反应30min，
测定590nm波长下测定吸光值，结果表明6h后基本达到水解完全。
2．2 发酵条件正交实验
选取摇瓶装量、接种量、NaN03及 H3PO4浓度四个影响因素为研究对象，取三个水平，按 (34)设计正交试验，其中目标函数为发酵液的0D 值，因素水平见下表1。由表2可知，极差值R的大小反映了各因素的水平变化对产栀子蓝色素指标的影响幅度，影响大小顺序为A>C>B>D。由正交实验计算结果推测，最优组合应为A1B2 C2 D1，此组合不在正交实验点内，故按A1B2 C2 D1其它条件不变进行最佳条件验证，结果测得0D值为0．609。
2．3 发酵培养条件的确定
2．3．1 发酵液pH对栀子蓝色素生成的影响
发酵培养基pH用稀HC1或NaOH溶液分别调至4．0．4．5、5．0、5．5、6．0、6．5、7．0，摇瓶装量3Oml、接种量4％、NaNO3及K2HPO4,分别为0．3％和0．4％进行试验，结果发酵培养基起始
pH为6.5所得结果最好。
2．3．2 培养温度对栀子蓝色素生成的影响
本实验选取培养温度分别为25℃、27℃、29℃、31℃ 和33~C，摇瓶装量3Oml、接种量4%、NaNO及K2HPO4分别为0．3％和0．4％进行试验，考察栀子蓝色素的生成量，结果29℃所得结果最好。
2．3．3 培养时间对栀子蓝色素生成量的影响
培养初期，菌丝体处于生长期，分泌的酶量少；培养中后期，菌丝体生长处于稳定期，酶分泌量逐渐增多。故从发酵12h开始，每隔4h取样测OD590值，结果培养16h OD590值开始增大，36h后0D590 值达到稳定，此时栀子蓝色素产量最高。
2．4 栀子蓝色素转化率的测定
2．4．1 栀子蓝色素转化标准曲线的制订
配置0D值分别为1、2、4、8、16、32的京尼平甙标准溶液，并分别从中取出2．0mL，再加入1．0mL 0．2mg／mL B一葡萄糖苷酶溶液，50℃水浴水解4h，然后再加入1．0mL 1％的谷氨酸钠溶液，80℃水浴中反应lh，然后在590nm波长下测定吸光值。结果见图1。
从图1可知，其回归方程为Y=0．2998X+0．0075，线性相关系数r：0．9999，线性回归关系显著。其中：Y为OD590的吸光度；X为0D238的吸光度。
2．4．2 栀子黄废液中糖类物质对013238值的干扰栀子黄废液中除京尼平甙外，另外还含有糖类、少量栀子黄色素等杂质，本实验测定了不同浓度的栀子黄色素在238nm和590nm处的吸收值，结果表明，同样浓度的栀子黄色素在238nm、59Ohm处吸光值都很小都远小于栀子甙和栀子蓝色素，故可忽略栀子黄色素的影响；栀子黄废液中的糖类可用70％乙醇沉淀，离心收集沉淀，用无水乙醇洗涤，得粗多糖，用蒸馏水复溶后测定栀子多糖在238nm处的吸光度值，结果表明吸光度值远小于栀子甙，故也可忽略栀子多糖的影响。
2．4．3 栀子蓝色素转化率的测定
在步骤2．3．3培养时间对栀子蓝色素生成量的影响试验中，分别取发酵12h、16h、20h、24h、36h后发酵液进行水解及转化，按方法1．2．4栀子蓝色素转化率的定义及2．4．1栀子蓝色素转化标准曲线的结果，计算转化率，结果见表3：
由表3可知，培养12h后取样检测，转化率较低，24h后转率较大于9o％ ，36h后转化率达98．43％，36h后转化率不再大。
2．5 离子交换树脂分离栀子蓝色素实验
通过静态吸附实验筛选出D301离子交换树脂为吸附剂，树脂按厂家规定预处理后装柱，取方法1．2．2栀子蓝色素液，用恒流泵上样，流速为3 mL／min，饱和吸附后，用lmol／L盐酸溶液作为洗脱剂，收集洗脱液，低温干燥，得蓝黑色粉末，酸价为55．6。
2．6 薄层层析法分析栀子蓝色素的纯度
将硅胶板llO~C活化后，点样(1Ot,．L)，15~C恒温展开，结果
见图2，展开后出现一个蓝色斑点，Rf=O．428
3 讨论
实验选用宇佐美曲霉(A,erei~ 凹泷)As一3．758为产B一葡萄糖苷酶菌株，对发酵培养基配方、发酵工艺条件与栀子蓝色素转化率之间的关系进行了较系统的探讨，并研究了离子交换树脂分离纯化栀子蓝色素的方法，获得了高色价的栀子蓝色素产品。结果为：选用发酵培养基配方为栀子黄废液4％、K2I-]PO4 0．4％、NAN03 0．3％、接种量4％(V／~)、摇瓶装量为80mL／250mL、起始pH值6．5、培养温度为29℃ 、摇床转速为200r／min、发酵培养时间为36h，发酵结束后置于50~C水解时间12h，过滤除去菌丝，滤液中加入0．7％谷氨酸钠，80℃反应1h，得栀子蓝色素液，转化率达98．43％。色素液经D301离子交换树脂吸附，再用1．Omol／L盐酸洗脱，洗脱液经低温干燥得到的栀子蓝色素，色价 达55．6，高于文献报道值及国家标准。
