朱薇玲(武汉工业学院,湖北武汉430023)
摘要:发酵液的氨基酸分析显示,谷氨酸、精氨酸、天门冬氨酸、丙氨酸易被棒状链霉菌利用,发酵培养基中添加上述氨基酸后,谷氨酸、精氨酸有利于克拉维酸的生物合成,适时添加谷氨酸、精氨酸可分别提高克拉维酸的产量约25%和12%;而蛋氨酸、半胱氨酸含Ｓ氨基酸对克拉维酸生物合成不利。不同来源的黄豆粉作发酵培养基氮源,因其组成中某些氨基酸含量的差异,可使克拉维酸的产量相差百分之十几。
关键词:克拉维酸;棒状链霉菌;谷氨酸;精氨酸;黄豆粉
中图分类号:Ｑ517 文献标识码:Ａ 文章编号:1004-311Ｘ(2002)05-0024-02
克拉维酸(ｃｌａｖｕｌａｎｉｃａｃｉｄ)又称棒酸,是棒状链霉菌(Ｓ ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ)产生的一种高效β-内酰胺酶抑制剂。它具有一个稠合的二环β-内酰胺结构,与青霉素结构相似,但不含Ｓ原子,见图1。国外科研人员对克拉维酸在微生物体内的生物合成途径及代谢方式进行了大量的研究,发现其结构中口恶唑环部分的合适前体可能为谷氨酸[1]和鸟氨酸[2],而鸟氨酸由精氨酸转化而来[3,4]。因棒状链霉菌在产生克拉维酸的同时还生成头霉素、青霉素Ｎ等含Ｓ抗生素,所以含Ｓ氨基酸对其生物合成不利。
在抗生素发酵研究中发现,多种抗生素如多肽类、糖肽类、β-内酰胺类、大环内脂类的发酵过程中,在适当的时间,补加适当的氨基酸可以增加相应目标产物的产量[5]。本实验首先对发酵液中氨基酸进行分析,确定氨基酸被产生菌利用的情况。然后考察几种被产生菌利用,可能有利于克拉维酸生物合成的氨基酸:谷氨酸、精氨酸、天门冬氨酸、丙氨酸,以及可能抑制克拉维酸合成的含Ｓ氨基酸:蛋氨酸、半胱氨酸在复合培养基中,对克拉维酸产量的影响。同时,实验对培养基中氮源物质黄豆粉的氨基酸组成进行了分析,试图从氨基酸含量差别上探明不同来源的黄豆粉对克拉维酸产量的影响。
1 材料
1.1 菌种:克拉维酸产生菌棒状链霉菌(Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ)162#,本院提供;生物测定用菌肺炎克氏杆菌(Ｋｌｅｂ ｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａ)。
1.2 培养基:
①斜面培养基为高氏一号培养基;
②种子培养基(%):黄豆粉1.5,甘油1.0,ＫＨ2ＰＯ4 0.1,ｐＨ6.5～7.0;
③发酵培养基(%):黄豆粉2.8,甘油1.8,ＫＨ2ＰＯ4 0.08,ｐＨ6.5～7.0。
2 方法
2.1 克拉维酸发酵:采用两级发酵工艺:孢子斜面→种子瓶→发酵瓶。培养条件:斜面接种后,于28℃培养7ｄ。种子培养时间48ｈ,发酵培养时间72ｈ,接种量5%,培养温度28℃,摇床转速250ｒ/ｍｉｎ,发酵瓶装量为250ｍｌ三角烧瓶装25ｍｌ培养基。
2.2 克拉维酸生物效价测定:采用管碟法[6]。
2.3 氨基酸测定:采用氨基酸分析仪测定[5]。发酵液进行适当稀释后测定;黄豆粉先用6Ｎ盐酸水解,然后测定。
3 结果与讨论
3.1 发酵液中氨基酸利用情况分析
发酵液中氨基酸含量变化是一个动态过程,即菌体对氨基酸的利用和菌体胞外蛋白酶分解培养基中蛋白质产生氨基酸之间的动态结果。分别测定培养基消后,培养24ｈ、36ｈ、48ｈ、60ｈ、72ｈ发酵液中氨基酸含量,其中谷氨酸、精氨酸、天门冬氨酸、丙氨酸在发酵过程的0～48ｈ中含量下降明显,说明这几种氨基酸被菌体利用或合成克拉维酸。而蛋氨酸、半胱氨酸含量变化不大,说明两者基本不被利用,见图2。
3.2 发酵液中添加谷氨酸、精氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸,对克拉维酸产量的影响分别在发酵0ｈ、24ｈ、48ｈ向发酵液中加入0.02%(20ｍｇ/100ｍｌ)的上述氨基酸,谷氨酸在0ｈ、24ｈ,精氨酸在24ｈ加入都会提高克拉维酸产量,说明两者参与克拉维酸生物合成。而天冬氨酸、丙氨酸对提高克拉维酸产量不明显,可能仅作用于菌体生长。而加入蛋氨酸、半胱氨酸会大大降低克拉维酸的产量,说明它们对克拉维酸合成不利,见表1。
3.3 氮源物质黄豆粉的氨基酸组成分析选取两种不同来源的黄豆粉1#、2#,对其氨基酸组成进行
分析,两者氨基酸总量相当,但2#黄豆粉比1#黄豆粉蛋氨酸、半胱氨酸分别低18.9%、29.7%,结果见表2。
在培养条件、培养基组分(除黄豆粉外,其他组分均非天然化合物)配比完全一致情况下,使用2#黄豆粉发酵单位为1045μｇ/ｍｌ,高于1#黄豆粉(914μｇ/ｍｌ),其差别应在于黄豆粉的不同,因黄豆粉是克拉维酸发酵的主要氮源,所以其品质对克拉维酸产量有很大影响,因此发酵用黄豆粉应考虑其氨基酸组成,使用含Ｓ氨基酸相对较低的黄豆粉作氮源。
4 结论
4.1 发酵液氨基酸分析显示谷氨酸、精氨酸、天门冬氨酸、丙氨酸易被菌体利用,适时添加谷氨酸、精氨酸可分别提高克拉维酸的产量约25%、12%。而蛋氨酸、半胱氨酸基本不被菌体利用,且两者不利克拉维酸的生物合成。
4.2 黄豆粉种类对克拉维酸产量具有较大影响,含蛋氨酸、半胱氨酸较低的黄豆粉有利于克拉维酸的生物合成,在其他组分不变的情况下,不同黄豆粉可使克拉维酸产量相差百分之十几。
参考文献:
[1]ＥｌｓｏｎＳＷ,ＯｌｉｖｅｒＲＳ Ｓｔｕｄｉｅｓｏｎｔｈｅｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆｃｌａｖｕｌａｎｉｃａｃｉｄ Ⅲ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎｏｆｇｌｕｔａｍｉｃａｃｉｄ[Ｊ] Ｊ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ,1982,35(1):81-86
[2]ＴｏｗｎｓｅｎｄＣｒａｉｇＡ,ＨｏＭｅｎｇＦｅｉ Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆｃｌａｖｕｌａｎｉｃａｃｉｄ:ｏｒｉｇｉｎｏｆｔｈｅＣ5ｕｎｉｔ[Ｊ] Ｊ ＡｍＣｈｅｍＳｏｃ,1985,107(4):1065-1066
[3]ＲｏｍｅｒｏＪ,ＬｉｒａｓＰ,ＭａｒｔｉｎＪＦ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎｏｆｏｒｎｉｔｈｉｎｅａｎｄａｒｇｉｎｉｎｅａｓｓｐｅｃｉｆｉｃｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓｏｆｃｌａｖｕｌａｎｉｃａｃｉｄ[Ｊ] ＡｐｐｌＥｎｖｉｒｏｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ,1986,52(4):892-897
[4]ＲｏｍｅｒｏＪ,ＲｏｍｅｒｏＪ,ＬｉｒａｓＰ,ｅｔａｌ ＩｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＳ ＣｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓｍｕｔａｎｔｓｉｎｔｈｅｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆｃｌａｖｕｌａｎｉｃａｃｉｄａｎｄｃｅｐｈａｍｙｃｉｎＣ[Ｊ] ＡｐｐｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ,1988,27(5-6):510-516
[5]鄢家林,等 氨基酸分析仪在抗生素发酵研究中的应用[Ｊ] 中国医药工业杂志,2002,33(4):202
[6]ＲｏｍｅｒｏＪ,ＬｉｒａｓＰ,ＭａｒｔｉｎＪＦ ＤｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｏｆｃｅｐｈａｍｙｃｉｎａｎｄｃｌａｖｕｌａｎｉｃａｃｉｄｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｉｎＳ Ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ[Ｊ] ＡｐｐｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ,1984,20(5):318-325
