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利用过滤培养技术生产大肠杆菌多核苷酸磷酸化酶的研究

   日期:2011-01-12     来源:发酵工业网    作者:发酵网    浏览:1523    评论:0    
  
聂实践 赵红 罗薇 桂铁 (北京市营养源研究所) 关键词:1. 过滤培养技术 2. 多核苷酸磷酸化酶 摘 要 利用中空纤维膜材料,在5升标准搅拌型自动控制发酵罐中进行大肠杆菌AS.1.183的过滤培养,大肠杆菌细胞的最高浓度可达250g/L(湿重,含水70%),细胞内多核苷酸磷化酶的活性可以稳定在80ug/g菌左右,发酵罐的体积生产效率比分批发酵提高近10倍。 多核苷酸磷酸化酶(Polynucleotide phophorylase.E.C.2.7.7.8)以下简称PNP ase)自从1955年被Ochoa[1]等人发现以来,它在核酸的研究中起了重要作用。由于基因工程学和抗菌素毒药物学的发展,人们对PNPase的应用产生了巨大的兴趣,需求量不断增加。PNPase广泛存在于细菌,酵母菌,真核细胞以及高等动植物细胞中,目前多采用大肠杆菌进行发酵[1.2],由于大肠杆菌在发酵过程中产生的代谢产物抑制其生长,在分批培养时细胞浓度很低,只有8-15g(湿重)/L,细胞中PNPase活性一般在20u/g(湿菌体)左右[3],需要较大的发酵设备进行生产,故分离时间长,PNPase的活性回收率低。采用膜分离与补料发酵耦联技术(过滤培养)可克服分批发酵过程中代谢产物抑制生长、发酵后期营养缺乏、以及连续培养过程中稀释速率不能过高等缺点[5。9。10。11。12]。对生产PNPas而言,可以达到在对数期未期收获大量菌体的目的。 材 料 与 方 法 1. 菌种:大肠杆菌(Egcherich Coli) AS.1.183由中国科学院微生物研究所提供。 2. 过滤培养系统:由以下部分组成见图一。 ① 自控发酵罐:日本L.E.MARUBISHI CO.LTD生产的5升磁力拌发酵罐。 ② 膜材料:天津纺织工学院生产的中空纤维,其性能参数见表一。 表一、HF-300过滤材料参数
膜型号 HF-300 纤维外径 1.2mm 膜材料 聚砜 有效面积 0.7m2 纤维总数 400-500根 截留分子量 50000Ddltons 膜长度 50cm 操作压力 <=120Kpa 外套直径 5.6cm pH范围 1-13 纤维内径 1.0cm 再生剂 次氯酸钠
③ 液体输送泵,美国Cole Parmer公司生产的蠕动泵用做循环泵,日本L.E.MARBISHI公司的两台蠕动泵控制加料和排料,发酵罐中的液位用硅胶管连接。 3.菌体收集:用日本TOMY SEIKO公司的CM-60RN离心机,3000rpm,30min ,可得湿菌泥,含水量为7.0%。 4.摇床:使用美国NBS公司旋转摇床。 5.培养基:葡萄糖20g,酵母酶解粉10g, Na2HPO4 5g, K2HPO4 8g,蒸馏水1000ml,经121℃灭菌15分钟,为分批培养和过滤培养的培养基。 6.分批发酵:将大肠杆菌AS1.183接种于装有100ml培养基的500ml三角瓶中,于37℃,转带为200pm下,摇瓶培养16小时,接10%的接种量 种,在装3升纯状基的 升发酵罐中27℃,搅拌400 PH7。0溶解氧饱和度5%以下,发酵培养。 7.过滤发酵:种子培养方法与分批发酵相同,接种后按分批发酵方式发酵1-2小时,再开动过滤循环系统,循环速度控制在2升/分,稀释速度为0.25-1.5h-1,其它条件用于批发酵。 8. 菌体集:3000rpm,离心30min,得到菌泥于-20℃冰箱储存。 9.测定方法: ① 菌体量测定:湿菌体(含水量70%)制备标准曲线。测定时了取发酵液1ml,稀释一定倍数,在570nm测定折光率,计算菌体重量。 ② 葡萄糖测定:取发酵液,离心分离的上清液按照3,5二硝基水杨酸法测定[4] ③ 大肠杆菌粗PNPase活力测定:取20g湿菌体(含水量70%),加入80目玻璃粉,在研体中研磨20-30分钟,然后悬浮于500ml,PH8.2-8.5的0.02M Tris-0.001M EDTA缓冲液中,搅拌30分钟后,在2-4℃,3000rpm离心30分钟,上清液为粗酶液[2]然后按PNPase紫外吸收法测定酶活力[3]。以30分钟内催经形成相当于1.0光密度(O.D)的多核苷酸的酶量定义为一个活力单位。 ④ 含氨量测定:取发酵液离心分离上清液,以微量凯士定氨法测定[4]

试 验 结 果

一、大肠杆菌分批发酵:
为了以后同过滤发酵方法的比较,了解PNPase活性同大肠杆菌生长的关系,首先对大肠杆菌分批发酵观察,结果见图(二、三)略。

结果说明在过滤发酵中大肠杆菌的生长速度比分批发酵加快,对数生长期延长,细胞中PNPase活性增高,菌体得量提高,不论在化批发酵还是在过滤发酵,比生长速率同PNPase活性都几乎同步。

三、过滤发酵和分批发酵过程碳,氮源变化:
在过滤发酵,稀释速率为D=1.0时,分批发酵条件同试验一,结果如下略:
结果表明在分批发酵的对数期未期碳源和氨源的量还比较充分,但菌体已不再增加,说明代谢产物抑制生长。在过滤发酵时碳源和氮源下降很快,当葡萄糖浓度维持在2g/L以下,对过滤发酵不构成限制因素。

四、不同流加速率影响:
在过滤发酵时培养基的不同流加速率(D)对菌体得率的影响见图十。在过滤发酵8小时时取样测定不同稀释速率下的PNPase活性,结果见表二和图十略
试验结果说明流加越快,大肠杆菌的得率越高,但由于受膜能力的限制,不能无限增大。而较低的D值虽然培养基得到充分利用,但会成为生长限制因素,不利于单位重量菌体PNPase活性的提高。

五、过滤发醇和分批发酵生产PNPase的比较:
以稀释速率D=1.0进行过滤发酵,其它条件两种发酵相同,结果见表三。

表三

项目 分批发酵 过滤发酵 发酵时间 8 8 细胞浓度(g湿菌体/1) 12 225 平均PNPase活力(u/g菌体) 20 80 培养基用量(L) 1.0 7.0 发酵罐产率(u/l) 240 18000 培养基产率(u/l) 240 2571 发酵体积得率(uh l) 6 450
比较结果可见采用过滤发酵生产大肠杆菌PNPase的产率比分批发酵提高很多。 讨 论 从分批发酵和过滤发酵的结果可以看出,过滤发酵可以大大减轻分批培养中大肠杆菌代谢产物的抑制,使细胞的生长速度加快,在几科同样长的发酵时间内,大肠杆菌的菌体浓度比分批发酵提高10多倍,大肠杆菌繁殖旺盛期延长,菌体内PNPase活性水平提高,这对于PNPase 在细胞中被水解的危险性比分批发酵小,因此过滤发酵法生产PNPase比分批发酵具有许多先进性。随着过滤发酵过程中细胞浓度的上升,许多在分批发酵时易于解决的问题显得难以解决,如高浓度细胞所需营养物质的供给,发酵过程沫控制,溶解氧]和pH控制,整个系统的循环可靠性,及膜组件的配置组件的配置等均需加以仔细考虑。 参考文献 1.谌章群:《生物化学与生物物理进展》Vo1,4,25,(1975)。 2.谭祖坤:《生物化学与生物物理学报》Vol,4,25,(1980)。 3.张树政:《酶制剂工业》,科学出版社。 4.张龙翔:《生化实验方法和技术》,高等教育出版社。 5.汪恩浩:《微生物学通报》,Vol,6,(1989). 6.汪恩浩:《生物工程学报》,Vol,3(2),(1987) 7.徐浩:《工业微生物学基础及基它应》,科学出版社。 8.Susy Tejayadi and Munir Cheryan: Applied Biochemistry and Biotechnology, Vol. 19,pp61,(1998) 9.Dominich Damiano: Applied Microbial Biotechnology.Vol,21,pp69,(1985). 10.Chang Woo Lee: Enzyme Microbial Technol, vol. 11,pp49,Jan,(1989) 11.Youl lark: Biotechnology and Bioengineering. Vol. 36,pp330,(1990) 12.Hidelaka Hatanaka: Applied Microbial Biotechnology. Vol. 27 pp470, (1988)

 
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